益腎續(xù)經(jīng)湯延緩絕經(jīng)過渡期大鼠卵巢功能衰老的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：探討女性絕經(jīng)過渡期早期的衰老機(jī)理，在前期臨床研究的基礎(chǔ)上，通過建立絕經(jīng)過渡期早期動(dòng)物模型，從內(nèi)分泌調(diào)控及Caspase依賴型卵巢凋亡通路兩個(gè)方面，探討益腎續(xù)經(jīng)湯在絕經(jīng)過渡期早期延緩卵巢衰老進(jìn)程的作用機(jī)制。
　　 理論研究絕經(jīng)過渡期早期標(biāo)志女性開始衰老，肝血不足是女性衰老早期的典型特點(diǎn)；衰老速度與腎氣的強(qiáng)弱密切相關(guān)；瘀血是衰老過程的必然產(chǎn)物，血瘀是加速衰老的重要因素。黎烈榮教授針對絕經(jīng)過渡期早期女性特殊的生理病理基礎(chǔ)，兼

2、顧開始虛損的肝腎二臟，養(yǎng)肝血、補(bǔ)腎精的同時(shí)，不忘通血脈，以免瘀血阻滯脈絡(luò)而加速衰老進(jìn)程，體現(xiàn)了“既病防變”的治未病思想。從女性的最早期衰老階段著手，在治療絕經(jīng)過渡期早期月經(jīng)不調(diào)的同時(shí)，中藥干預(yù)可延緩女性衰老進(jìn)程，以期推遲絕經(jīng)年齡，減少絕經(jīng)過渡期晚期圍絕經(jīng)期綜合征的發(fā)生，這正是“未病先防”的具體體現(xiàn)。
　　 研究方法：本實(shí)驗(yàn)以絕經(jīng)過渡期(Menopausal Transition，MT)wistar雌性大鼠為研究對象，選取陰道脫落

3、細(xì)胞涂片表現(xiàn)為動(dòng)情間期延長、動(dòng)情周期紊亂者納入實(shí)驗(yàn)。以大鼠月齡區(qū)分MT早期(10月齡)和MT晚期(11～12月齡)。選取符合MT早期標(biāo)準(zhǔn)的大鼠24只，隨機(jī)分為MT早期模型組、MT早期治療組和西藥對照組，每組8只；選取符合MT晚期標(biāo)準(zhǔn)的大鼠16只，隨機(jī)分為MT晚期模型組、MT晚期治療組，每組8只；另選取4～6月齡大鼠8只，作為青年對照組(青年組)。MT早期模型組、MT晚期模型組、青年組分別給予生理鹽水；MT早期治療組和MT晚期治療組給予益

4、腎續(xù)經(jīng)湯；西藥組予以去氧孕烯炔雌醇水溶液灌胃。各組每日均按1ml/100g灌胃，連續(xù)灌胃15天，末次給藥24小時(shí)后，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，酶聯(lián)免疫吸附法檢測抑制素B(INHB)、促卵泡素(FSH)、雌二醇(E2)水平；摘取卵巢，以電子天平稱取卵巢濕重，將臟器濕重?fù)Q算成臟器指數(shù)。石蠟包埋，常規(guī)切片4μm，左側(cè)卵巢切片HE染色用于光鏡下觀察卵巢形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，免疫組化SP法測定各組大鼠右側(cè)卵巢Fas、Cytc、Caspase-12、Caspa

5、se-3的表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、MT早期模型組INHB水平低于青年組(P＜0.01)，MT晚期模型組低于MT早期模型組(P＜0.01)。MT早期治療組INHB水平顯著高于MT早期模型組(P＜0.01)。MT晚期治療組INHB水平與MT晚期模型組INHB水平差異無顯著意義(P＞0.05)。西藥組與MT早期模型組INHB水平差異無顯著性(P＞0.05)。
　　 2、MT早期模型組FSH水平高于青年組(P

6、＜0.01)；MT晚期模型組高于MT早期模型組(P＜0.01)。MT早期治療組FSH水平接近青年組(P＞0.05)。西藥組FSH水平低于MT早期模型組(P＜0.01)，但高于青年組(P＜0.05)。MT晚期治療組與MT晚期模型組FSH差異無顯著性(P＞0.05)
　　 3、MT早期模型組E2水平明顯高于青年組(P＜0.01)，MT晚期模型組顯著低于青年組(P＜0.01)。使用益腎續(xù)經(jīng)湯后，MT早期治療組E2水平較MT早期模型組明

7、顯降低(P＜0.01)，MT晚期治療組高于MT晚期模型組(P＜0.01)。
　　 4、青年組卵巢指數(shù)高于MT早期模型組(P＜0.01)，MT早期模型組高于MT晚期模型組(P＜0.01)。MT早期治療組卵巢指數(shù)顯著高于MT早期模型組(P＜0.05)。MT晚期治療組卵巢指數(shù)雖略高于MT晚期模型組，但差異無顯著意義(P＞0.05)。西藥組與MT早期模型組差異無顯著性(P＞0.05)。
　　 5、光鏡下可見，MT早期治療組和青年

8、組大鼠卵巢內(nèi)有較多數(shù)目的初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、竇狀卵泡等各級(jí)生長發(fā)育卵泡，黃體、白體等都可見，卵泡形狀規(guī)則，體積較大。MT早期模型組和西藥組大鼠卵巢皮質(zhì)內(nèi)卵泡數(shù)目較少，卵泡形狀不規(guī)則。MT晚期模型組和MT晚期治療組大鼠卵巢內(nèi)生長卵泡明顯減少，卵泡結(jié)構(gòu)紊亂。
　　 6、MT晚期模型組卵巢Fas表達(dá)水平顯著高于MT早期模型組(P＜0.01)；MT早期模型組明顯高于青年組(P＜0.01)。使用益腎續(xù)經(jīng)湯后，MT早期治療組較MT早期模型組

9、卵巢Fas表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01)，MT晚期治療組與MT晚期模型組差異無顯著性(P＞0.05)。西藥組卵巢Fas表達(dá)水平與MT早期模型組差異無顯著意義(P＞0.05)。
　　 7、MT晚期模型組卵巢Caspase-12表達(dá)水平顯著高于MT早期模型組(P＜0.05)，MT早期模型組明顯高于青年組(P＜0.01)。MT早期治療組卵巢Caspase-12表達(dá)水平明顯低于MT早期模型組(P＜0.05)，與青年組水平接近(P＞0.

10、05)。MT晚期治療組亦可降低卵巢Caspase-12表達(dá)水平(P＜0.05)。西藥組與MT早期模型組差異無顯著意義(P＞0.05)。
　　 8、青年組卵巢CytC、Caspase-3表達(dá)最低，MT早期模型組高于青年組(P＜0.01、P＜0.01)，MT晚期模型組高于MT早期模型組(P＜0.01、P＜0.01)。MT早期治療組卵巢CytC、Caspase-3表達(dá)均顯著低于MT早期模型組(P＜0.01、P＜0.05)，但高于青年組

11、(P＜0.01、P＜0.01)。MT晚期治療組卵巢CytC、Caspase-3表達(dá)與MT早期模型組無明顯差異(P＞0.05、P＞0.05)。西藥組卵巢CytC、Caspase-3表達(dá)低于MT早期模型組，差異無顯著性(P＞0.05)。
　　 9、未給藥組全部大鼠卵巢Caspase-3表達(dá)與其他凋亡指標(biāo)的兩因素相關(guān)分析顯示，Caspase-3與Fas(r=0.453，P＜0.001)、Caspase-12(r=0.798，P＜0.0

12、01)和CytC(r=0.935，P＜0.001)均呈顯著正相關(guān)。
　　 結(jié)論：導(dǎo)師黎烈榮教授提出在絕經(jīng)過渡期早期以養(yǎng)肝血、補(bǔ)腎精、通血脈立論，擬定益腎續(xù)經(jīng)湯治療絕經(jīng)過渡期早期月經(jīng)不調(diào)，延緩女性衰老進(jìn)程。本課題在前期臨床研究療效確切的基礎(chǔ)上，首次建立絕經(jīng)過渡期早期模型，為研究者未來從實(shí)驗(yàn)角度研究絕經(jīng)過渡期提供了研究基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)研究表明，在MT早期使用益腎續(xù)經(jīng)湯，能夠升高INHB水平，增強(qiáng)INHB對FSH的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，從而降低FSH

13、水平，可以調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育和閉鎖交替引起的雌激素波動(dòng)至正常狀態(tài)。益腎續(xù)經(jīng)湯通過調(diào)整紊亂的激素水平，改善激素效應(yīng)，使激素作用的靶器官蛋白質(zhì)合成增加，降低卵巢重量下降速度，對生殖軸具有正向調(diào)節(jié)作用。益腎續(xù)經(jīng)湯能通過降低三條經(jīng)典凋亡途徑的啟動(dòng)凋亡因子Fas、CytC、Caspase-12的表達(dá)，從多靶點(diǎn)降低凋亡啟始酶的活化或釋放，抑制三條Caspase依賴型鏈?zhǔn)降鞍酌讣?jí)聯(lián)反應(yīng)，繼而降低卵巢Caspase-3蛋白的表達(dá)，阻止卵巢Caspase依賴型