穩(wěn)態(tài)有效血藥濃度下丙戊酸鈉對(duì)驚厥持續(xù)狀態(tài)后大鼠空間認(rèn)知功能的影響.pdf

1、第一部分、穩(wěn)態(tài)有效血藥濃度下丙戊酸鈉對(duì)驚厥持續(xù)狀態(tài)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響
　　 實(shí)驗(yàn)研究一、維持丙戊酸鈉及苯巴比妥穩(wěn)態(tài)有效血藥濃度給藥方案的確立
　　 目的：確立不同齡期不同性別的Wistar鼠維持丙戊酸鈉（sodiumvalproate，VPA）、苯巴比妥（Phenobarbital，PB）穩(wěn)態(tài)有效血藥濃度的給藥方案。
　　 方法：選擇生后15天（P15）、生后35天（P35）日齡Wistar鼠，分別以不同

2、劑量、不同時(shí)間間隔經(jīng)口灌胃給藥。VPA給藥后2天、PB給藥后5天經(jīng)尾靜脈取血，以熒光偏振免疫分析方法檢測(cè)血藥濃度。
　　 結(jié)果：（1）P15雄性大鼠維持VPA、PB穩(wěn)態(tài)有效血藥濃度的給藥方案分別為每次75 mg/kg（12次/日）、每次10 mg/kg（2次/日），P35雄性大鼠維持VPA、PB穩(wěn)態(tài)有效血藥濃度的給藥方案分別為每次350mg/kg（6次/日）、每次35 mg/kg（2次/日）；（2）P15、P35大鼠在每次200

3、 mg/kg（6次/日）VPA給藥方案下血藥濃度分別為150.00±0.00μg/ml、34.83±8.47μg/ml，在每次30 mg/kg（2次/日）的PB給藥方案TP15、P35大鼠血藥濃度分別為42.15±6.34μg/ml、13.00±3.47μg/ml；（3）每次分別為200 mg/kg、300 mg/kg、400 mg/kg，6次/日的給藥方案中VPA血藥濃度在雄性大鼠顯著高于雌性大鼠，每次45 mg/kg、60 mg/k

4、g，2次/日PB給藥方案中其血藥濃度雄性大鼠血藥濃度顯著低于雌性大鼠；（4）維持VPA穩(wěn)態(tài)有效血藥濃度的用藥劑量與其致死劑量接近，每日用量分別為2400 mg/kg、2700 mg/kg。
　　 結(jié)論：（1）維持VPA穩(wěn)態(tài)有效血藥濃度的給藥方案在P15、P35大鼠分別為每次75 mg/kg（12次/日）、每次350 mg/kg（6次/日），PB給藥方案分別為每次10 mg/kg（2次/日）、每次35 mg/kg（2次/日）；（2

5、）VPA、PB代謝存在年齡依賴性，P35大鼠代謝速度高于P15大鼠；（3）VPA、PB代謝存在性別依賴性，VPA在雌性大鼠代謝快于雄性大鼠，PB在雄性大鼠代謝快于雌性大鼠，且雌性大鼠不適合于VPA穩(wěn)態(tài)有效血藥濃度條件下的實(shí)驗(yàn)。
　　 實(shí)驗(yàn)研究二、穩(wěn)態(tài)有效血濃度VPA對(duì)VSE大鼠空間學(xué)習(xí)記憶智能力的影響
　　 目的：以PB為對(duì)照，研究穩(wěn)態(tài)有效血藥濃度條件下VPA對(duì)驚厥性癲癇持續(xù)狀態(tài)（convulsive status ep

6、ilepticus，CSE）后Wistar鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響。
　　 方法：制作氯化鋰-匹羅卡品CSE模型，利用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VPA對(duì)CSE后不同年齡Wistar鼠空間參考記憶（spatial reference memory，SRM）與空間工作記憶（spatial working memory，SWM）的影響。
　　 結(jié)果：（1）P35大鼠CSE后學(xué)習(xí)記憶能力損傷損傷嚴(yán)重，而在P15大鼠損傷不明顯，V

7、PA可改善P35大鼠CSE后空間學(xué)習(xí)記憶能力，且對(duì)SRM與SWM的作用具有一致性；（2）VPA對(duì)P15、P35正常大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力均具有損傷作用，且對(duì)SRM與SWM的作用具有一致性；（3）穩(wěn)態(tài)有效血藥濃度條件下，服藥期間VPA、PB對(duì)不同齡期CSE大鼠及正常大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響程度類似。
　　 結(jié)論：VPA可顯著改善P35大鼠CSE后空間認(rèn)知功能障礙，但VPA對(duì)正常P15、P35大鼠空間記憶力造成明顯損傷。穩(wěn)態(tài)有效血

8、藥濃度條件下，VPA與PB對(duì)正常及模型動(dòng)物空間認(rèn)知功能的影響作用一致。
　　 第二部分、有效治療濃度VPA對(duì)CSE模型大鼠海馬腦區(qū)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的影響
　　 實(shí)驗(yàn)研究一、丙戊酸鈉在體干預(yù)對(duì)海馬腦區(qū)LTP的影響
　　 目的：探索在體維持穩(wěn)態(tài)有效濃度條件下VPA對(duì)CSE后海馬腦區(qū)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（10ng-term potentiation，LTP）現(xiàn)象的影響，并針對(duì)LTP形成機(jī)制中的關(guān)鍵分子研究VPA影響LTP變化的內(nèi)在可能

9、機(jī)制。
　　 方法：制作CSE模型并給予VPA干預(yù)，制備急性海馬腦片，利用膜片鉗平臺(tái)觀察高頻電刺激（high frequency stimulation，HFS）后VPA干預(yù)對(duì)興奮性突觸后場(chǎng)電位（field excitatory postsynaptic potential.fEPSP）的影響，利用Western blot檢測(cè)鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（calcium/calmodulin dependent protein

10、kinase-Ⅱ，CaMKⅡ）與磷酸化CaMKⅡ（P-CaMKⅡ）表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：（1）P35大鼠CSE后LTP誘導(dǎo)成功率與維持時(shí)間明顯低于對(duì)照組，VPA在體干預(yù)可提高P35大鼠CSE后LTP誘導(dǎo)成功率及維持時(shí)間；而CSE對(duì)P15大鼠海馬腦片LTP誘導(dǎo)成功率與維持時(shí)間的影響未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，僅fEPSPS幅度存在增大趨勢(shì)。VPA在體干預(yù)對(duì)正常P15、P35大鼠LTP的誘導(dǎo)與維持則無(wú)明顯影響；（2）CSE對(duì)P15大鼠Ca

11、MKⅡ及p-CaMKⅡ的表達(dá)均無(wú)明顯影響，而VPA在體干預(yù)可抑制CaMKⅡ及p-CaMKⅡ的表達(dá)；CSE對(duì)P35大鼠CaMKⅡ及p-CaMKⅡ表達(dá)的影響均未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，僅p-CaMKⅡ的表達(dá)出現(xiàn)增高趨勢(shì)，VPA干預(yù)可抑制p-CaMKⅡ的表達(dá)，但對(duì)CaMKⅡ的表達(dá)未體現(xiàn)抑制作用。
　　 結(jié)論：（1）CSE對(duì)LTP誘導(dǎo)成功率與維持時(shí)間的影響存在年齡依賴性，幼年鼠輕于青春期大鼠，其損傷機(jī)制與CaMKⅡ的表達(dá)與磷酸化無(wú)因果聯(lián)系；（2

12、）VPA改善CSE后大鼠空間認(rèn)知功能與提高LTP誘導(dǎo)成功率及延長(zhǎng)LTP維持時(shí)間密切相關(guān)；（3）VPA抑制CaMKⅡ的表達(dá)與磷酸化而對(duì)LTP未表現(xiàn)明顯抑制作用的矛盾可能與VPA的洗脫作用有關(guān)。
　　 實(shí)驗(yàn)研究二、丙戊酸鈉離體干預(yù)對(duì)海馬腦區(qū)LTP的影響
　　 目的：排除VPA洗脫作用，探索VPA離體干預(yù)對(duì)海馬腦區(qū)LTP現(xiàn)象的影響，并針對(duì)LTP形成機(jī)制中的關(guān)鍵分子研究VPA影響LTP變化的內(nèi)在可能機(jī)制。
　　 方法：制

13、備急性海馬腦片，利用膜片鉗平臺(tái)觀察VPA對(duì)雙脈沖易化（paired-pulse facilitation，PPF）的影響，并觀察HFS前后VPA干預(yù)對(duì)fEPSP的影響，利用Western blot檢測(cè)CaMKⅡ及P-CaMKⅡ在LTP誘導(dǎo)成功腦片中的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：（1）有效藥物濃度條件下VPA抑制基礎(chǔ)刺激下fEPSP幅度，但對(duì)PPF無(wú)明顯抑制作用；（2）VPA體外干預(yù)可抑制LTP現(xiàn)象的誘導(dǎo)，但對(duì)已誘導(dǎo)成功LTP的維持階

14、段無(wú)明顯抑制作用；（3）VPA預(yù)干預(yù)可降低p-CaMKⅡ的表達(dá)，LTP誘導(dǎo)成功后VPA對(duì)p-CaMKⅡ的表達(dá)無(wú)明顯抑制作用；而CaMKⅡ表達(dá)無(wú)論在LTP誘導(dǎo)或維持階段給予VPA均無(wú)明顯變化。
　　 結(jié)論：有效藥物濃度VPA預(yù)干預(yù)可能僅通過(guò)突觸后機(jī)制影響神經(jīng)元內(nèi)CaMKⅡ的磷酸化進(jìn)而抑制LTP的誘導(dǎo)與維持，對(duì)已經(jīng)誘導(dǎo)成功的LTP現(xiàn)象無(wú)抑制作用。
　　 實(shí)驗(yàn)研究三、 VPA對(duì)神經(jīng)元胞內(nèi)Ca2+濃度的影響
　　 目的：

15、探索NMDA作用下VPA對(duì)海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度的影響
　　 方法：培養(yǎng)7天的海馬神經(jīng)元進(jìn)行神經(jīng)元鑒定及活性檢測(cè)，然后分為3組，即對(duì)照組、VPA組、陰性對(duì)照組，三組均給予0.1 mM NMDA進(jìn)行刺激，利用鈣離子測(cè)定儀觀察神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度的變化。VPA組在給予NMDA刺激前10 min給予70μg/ml VPA進(jìn)行預(yù)處理。
　　 結(jié)果：VPA可顯著降低NMDA刺激后340nm、380nm兩熒光比值，神經(jīng)元胞體呈現(xiàn)明

16、亮的紅色或橙紅色變暗。
　　 結(jié)論：VPA可顯著降低由NMDA刺激引起的神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度的提高。
　　 第三部分、丙戊酸鈉對(duì)癲癇發(fā)作后干細(xì)胞增殖與新生神經(jīng)元遷移的影響
　　 目的：研究穩(wěn)態(tài)有效血藥濃度條件下，VPA對(duì)CSE后海馬腦區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem/progenitor cells，NSCs/NPCs）增殖、遷移及新生神經(jīng)元遷移的影響。
　　 方法：制作CSE模型，在體5-溴2-脫氧

17、尿嘧啶核苷（5-bromo2-deoxyuridine，BrdU）標(biāo)記新生細(xì)胞。采用免疫組化方法分別檢測(cè)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞與Doublecortin（DCX）陽(yáng)性神經(jīng)元在VPA干預(yù)后在海馬齒狀回、CA1區(qū)的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：P15與P15大鼠CSE后海馬顆粒細(xì)胞層較對(duì)照組分散，齒狀回顆粒細(xì)胞下層（subgranularzone，SGZ）區(qū)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞與DCX陽(yáng)性神經(jīng)元明顯增多，部分出現(xiàn)于齒狀回門區(qū)，且有向CA1區(qū)遷移的趨