游離脂肪酸及葡萄糖對大鼠主動脈內(nèi)皮細胞的影響及作用機制.pdf

1、目的：
　　 為研究脂毒性對大血管的損傷作用，我們利用游離脂肪酸(Free Fatty Acids，F(xiàn)FAs)干預大鼠主動脈內(nèi)皮細胞(Rat Aorta Endothelial Cell，RAEC)，探討游離脂肪酸對大鼠主動脈內(nèi)皮細胞增殖與凋亡的影響及作用機制。
　　 方法：
　　 原代培養(yǎng)大鼠主動脈內(nèi)皮細胞(RACE)，采用不同濃度的葡萄糖(5.5mmol/L,30mmol/L)及棕櫚酸(200μmol/L、4

2、00μmol/L、600μmol/l。)單獨或聯(lián)合作用于培養(yǎng)成功的RAEC24h、48h、72h，設(shè)立正常對照組和d-BSA對照組。①倒置顯微鏡下形態(tài)學觀察；②采用細胞計數(shù)法繪制細胞增長曲線：③免疫組織化學染色方法鑒定內(nèi)皮細胞；④應用MTT比色法檢測不同環(huán)境下FFAs對RAEC增殖的影響；⑤免疫細胞化學法檢測處理前后RAEC中白細胞介素-8(IL-8)，B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(B-cell lymphoma2，bcl-2)，Bcl

3、-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Assaciated X protein,bax)表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 ①RAEC形態(tài)學觀察原代細胞在培養(yǎng)5-7天后，在主動脈貼壁附近可見少量游出的內(nèi)皮細胞；培養(yǎng)到12-13天，可見遷移出的細胞呈片生長，70％-80%單層融合，分布密度不均。培養(yǎng)出的內(nèi)皮細胞呈梭形、多角形，邊界清晰，胞漿豐富，核清晰，鋪滿后，細胞排列緊密，可見典型的“鋪路石”狀排列的單層細胞，并有接觸抑制現(xiàn)象。培養(yǎng)至

4、7-8代后，細胞變瘦小，分泌物增多，可見細胞分化，成老化狀態(tài)。
　　 ②細胞生長曲線大鼠主動脈內(nèi)皮細胞在傳代接種2h后開始貼壁，24h后90%細胞貼壁生長，24h-48h間細胞量有所減少,48h后可見新長出的細胞為單層、互不重疊，傳代細胞增殖速率較原代細胞增長稍快，第4-7天為對數(shù)生長期，第8-9天為平臺期。細胞生長曲線呈“S”型。
　　 ③內(nèi)皮細胞的鑒定倒置顯微鏡下可見細胞呈典型的“鋪路石”狀單層排列貼壁生長，CD31

5、相關(guān)抗原鑒定示：細胞呈圓形、梭形或多邊形，細胞胞漿內(nèi)可見棕黃色顆粒，而對照組內(nèi)未見著色，證實培養(yǎng)的細胞為大鼠主動脈內(nèi)皮細胞。
　　 ④MTT檢測RAEC增殖不同劑量的棕櫚酸、葡萄糖及聯(lián)合培養(yǎng)組處理內(nèi)皮細胞24h、48h、72h后，與正常培養(yǎng)液組及d-BSA對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其中24h低劑量PA組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；相同濃度時，24h與72h組內(nèi)比較，高糖組、高、中、低劑量棕櫚

6、酸組差異顯著(P＜0.01)，聯(lián)合培養(yǎng)組不同時間段差異均顯著(P＜0.01)；高糖組、中、高劑量棕櫚酸組48h與72h組內(nèi)比較，24h與48h組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，低劑量組24h與48h,48h與72h組內(nèi)比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。正常培養(yǎng)液組與d-BSA組相比無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 ⑤免疫組化法檢測結(jié)果正常對照組、d-BSA對照組培養(yǎng)內(nèi)皮細胞48h后，IL-8、BAX幾乎不表達或弱

7、表達，兩對照組之間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。不同濃度FFAs、高糖及聯(lián)合培養(yǎng)組處理細胞后，細胞IL-8表達明顯增高，且具有劑量依賴關(guān)系，與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；細胞bcl-2表達隨濃度的增高表達逐漸減弱，與正常對照組及d-BSA對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；而細胞BAX表達則隨濃度的增加表達亦增強，與正常對照組及d-BSA組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Bcl-2/bax比值隨葡

8、萄糖及棕櫚酸濃度增高逐漸減低，聯(lián)合培養(yǎng)組為甚。
　　 結(jié)論：
　　 體外培養(yǎng)并獲得7代內(nèi)皮細胞，形態(tài)學觀察及CD31相關(guān)抗原鑒定證實本實驗成功的培養(yǎng)原代及傳代生長的內(nèi)皮細胞；本培養(yǎng)方法操作簡便，周期較短，價格低廉，內(nèi)皮細胞純度較高，適宜實驗所需。高濃度FFAs及高糖具有抑制內(nèi)皮細胞生長，促進其凋亡的作用，并且具有時間濃度依賴性。這種作用機制可能是通過葡萄糖及棕櫚酸酯參與P13K/AKT等途徑激活氧化應激誘導細胞凋亡。同時