R-Ras與C3G的相互作用及生物學(xué)意義的研究.pdf

1、R-Ras屬于Ras家族小分子量G蛋白，與Ras具有55％的氨基酸序列相似性，R-Ras和Ras家族的其他成員一樣,結(jié)合GTP時(shí)處于激活狀態(tài)，并通過(guò)其下游效應(yīng)物，將胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到胞內(nèi)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)功能。C3G為Rap1的特異性的鳥(niǎo)苷酸交換因子,近年的研究表明C3G能與R-Ras相互作用。本研究的前期工作也表明全長(zhǎng)的C3G能與R-Ras相互作用，而C端催化結(jié)構(gòu)域與R-Ras相互作用較弱。為了進(jìn)一步研究R-Ras與C3G的相互作用極其兩

2、者相互作用的生物學(xué)意義，首先檢測(cè)了R-Ras與C3G缺失C末端催化結(jié)構(gòu)域的缺失突變體C3GdelC的體外相互作用，通過(guò)在HEK293中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C3GdelC，收獲其蛋白并將其與外源表達(dá)GST-R-Ras進(jìn)行GST-pull down及Western blot，結(jié)果表明R-Ras與C3GdelC在體外是相互作用的。同時(shí)將R-Ras與C3GdelC共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過(guò)免疫共沉淀及Western blot檢測(cè)出在細(xì)胞內(nèi)R-Ras與C3

3、GdelC也是相互作用的。接著通過(guò)Overlay的方法，研究了R-Ras與C3GdelC相互作用的作用方式，將轉(zhuǎn)移到PVDF膜上的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的C3GdelC與外源表達(dá)的GST-R-Ras蛋白共孵育，Western blot的結(jié)果表明，GST-R-Ras能與膜結(jié)合的C3GdelC相互作用，R-Ras與C3G的相互作用是直接的。最后通過(guò)GST-pull down及Western blot的方法，找到了R-Ras與C3G相互作用的最小結(jié)構(gòu)域?yàn)?/p>

4、第210-406氨基酸殘基。為了研究R-Ras與C3GdelC相互作用的生物學(xué)意義，首先將R-Ras與C3GdelC共表達(dá)于NIH3T3細(xì)胞中，通過(guò)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)研究?jī)烧咴诩?xì)胞中的定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)C3GdelC主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，少部分在細(xì)胞膜上也有分布，而R-Ras主要分布在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜，二者主要共定位于胞質(zhì)和部分質(zhì)膜區(qū)附近。其次通過(guò)GST-RBD-pull down實(shí)驗(yàn)對(duì)R-Ras進(jìn)行活性化分析，結(jié)果表明C3GdelC能促進(jìn)R-R