布格呋喃與CYP450-P-糖蛋白的相互作用及生物學效應(yīng).pdf

1、藥物代謝是新藥研究過程中必不可少的重要環(huán)節(jié)，口服藥物的生物利用度和藥物相互作用是評價藥物代謝特征的重要指標。已知在藥物代謝過程中，當兩種或多種藥物經(jīng)同-代謝酶代謝時，藥物間則可能由于對藥酶的競爭而發(fā)生相互作用，致使血藥濃度顯著增加，導致嚴重的不良反應(yīng)。此外，藥物進入體內(nèi)在受到藥酶代謝轉(zhuǎn)化的同時，也可誘導或抑制某些CYP450同工酶的表達水平和代謝活性，從而調(diào)節(jié)自身和其它化合物的代謝轉(zhuǎn)化，以致改變新藥的安全性和療效。因此，在新藥研發(fā)的臨床

2、前階段明確藥物的主要代謝途徑以及對藥酶的誘導和抑制，對于認識個體間代謝差異和預(yù)測潛在的藥物-藥物相互作用具有重要意義，此外，還有助于明確某些代謝產(chǎn)物的藥理學特性和進-步開發(fā)的價值。
　　 P-糖蛋白是一類ATP依賴性膜蛋白，在小腸粘膜、血腦屏障、肝細胞、腎及睪丸等器官均有分布，是上述生理屏障的重要組成部分并發(fā)揮泵出作用，阻礙某些有害物質(zhì)進入這些特定部位，同時也可加快藥物從這些組織部位的消除，從而影響藥物的吸收、分布、代謝和排泄。

3、藥物對上述器官P-糖蛋白的調(diào)控可引發(fā)非代謝性的藥物相互作用。因此，有必要在新藥研發(fā)階段關(guān)注藥物與P-糖蛋白之間的相互影響。
　　 雖然肝臟是人體最主要的代謝器官，參與大多數(shù)藥物和毒物的生物轉(zhuǎn)化，但除肝臟之外，腸道和腎臟作為吸收和排泄器官也表達部分CYP同工酶和轉(zhuǎn)運蛋白，在藥物代謝中的作用同樣不可忽視。
　　 布格呋喃是由中國醫(yī)學科學院藥物研究所研發(fā)的抗焦慮新藥。前期體內(nèi)藥代動力學結(jié)果顯示，大鼠口服布格呋喃后具有半衰期短，

4、生物利用度較低，靶器官分布少的特點。布格呋喃可經(jīng)CYP450代謝，同時也是腸道P-糖蛋白的底物，但參與布格呋喃代謝的同工酶亞型、布格呋喃與CYP450以及P-糖蛋白相互作用的分子機制和由此產(chǎn)生的生物學效應(yīng)還有待進一步明確。為此，本研究可分為以下幾方面內(nèi)容：
　　 1.采用大鼠、人肝微粒體和重組人源CYP450同工酶溫孵法，應(yīng)用GC-MS分析技術(shù)，研究參與布格呋喃Ⅰ相代謝的同工酶類型和產(chǎn)物生成的相關(guān)性。2.從酶活性水平、mRNA轉(zhuǎn)

5、錄水平和蛋白表達水平評價多次口服不同劑量布格呋喃對大鼠肝臟CYP的調(diào)控作用。3.應(yīng)用探針底物法、RT-PCR、western-blotting方法從細胞、亞細胞組分、mRNA和蛋白水平考察布格呋喃對小腸CYP3A、P-糖蛋白和腎CYP2C11、2E1以及P-糖蛋白的影響。4.應(yīng)用整體動物、原位腦灌流模型及構(gòu)建P-糖蛋白高表達MDCK細胞株研究P-糖蛋白對布格呋喃腦分布以及多次口服布格呋喃對腦P-糖蛋白的影響。5-根據(jù)布格呋喃對藥物代謝酶

6、和外排蛋白的研究結(jié)果，選取可能與布格呋喃合用的四種臨床藥物，考察布格呋喃與其他藥物合用對藥代動力學的影響。
　　 研究結(jié)果表明：
　　 一、布格呋喃在大鼠/人肝臟微粒體主要代謝產(chǎn)物鑒定及比較
　　 1.1本研究應(yīng)用的GC-MS分析方法可有效分離布格呋喃在微粒體溫孵體系中的代謝產(chǎn)物并初步鑒定其結(jié)構(gòu)類型。
　　 1.2布格呋喃在大鼠肝微粒體中可代謝為一羥基、一羰基和二羥基代謝產(chǎn)物。布格呋喃在人肝微粒體中的代謝

7、特征與大鼠相似，同樣生成一羥基、一羰基和二羥基類型代謝產(chǎn)物，但代謝速率較大鼠慢，生成的代謝產(chǎn)物種類較大鼠中少。
　　 1.3應(yīng)用CYP同工酶選擇性抑制劑研究結(jié)果顯示，在肝微粒體加入CYP3A4和CYP2E1的抑制劑酮康唑和戒酒硫后，布格呋喃消除速率減慢，各代謝產(chǎn)物生成量明顯減少。體外重組人源CYP3A4和CYP2E1溫孵結(jié)果表明，布格呋喃在重組人源CYP3A4中可迅速被代謝，代謝產(chǎn)物主要為一羰基和二羥基產(chǎn)物。綜合以上結(jié)果，可初步

8、判斷CYP3A4是參與布格呋喃代謝的主要CYP同工酶，一羰基和二羥基化是其催化的主要反應(yīng)。
　　 二、布格呋喃對大鼠肝臟CYP450s的調(diào)控
　　 2.1布格呋喃（4、16、64mg/kg，1次/日×7）多次給藥可提高大鼠肝臟CYP1A2和2E1活性、基因和蛋白表達水平也明顯增加，并呈一定劑量-效應(yīng)關(guān)系，但誘導強度弱于經(jīng)典誘導劑β-萘黃銅和乙醇。
　　 2.2多次口服布格呋喃可抑制大鼠肝臟CYP2D活性，對CYP

9、2C6和CYP2C11活性均有一定程度的誘導作用，但對CYP3A活性無明顯影響。
　　 2.3布格呋喃在自身處理的肝微粒體中代謝速率有所提高，提示布格呋喃誘導自身代謝與其對肝臟藥物代謝酶的誘導有關(guān)。
　　 2.4布格呋喃在濃度為1-10μM時對CYP450同工酶存在不同程度抑制作用，但濃度降為0.5μM時對CYP450同工酶則無顯著性影響。
　　 三、布格呋喃對大鼠腸道和腎臟主要CYP450s和P-糖蛋白的調(diào)控<

10、br>　　 3.1布格呋喃可上調(diào)大鼠小腸CYP3A的催化活性和蛋白表達，誘導人源腸道LS-174T細胞CYP3A4蛋白含量升高，提示布格呋喃可通過調(diào)控小腸CYP3A蛋白含量提高其的催化活性。同時，布格呋喃亦可上調(diào)腸道P-糖蛋白含量。應(yīng)用Caco-2細胞Transwell模型研究發(fā)現(xiàn)，布格呋喃100μM處理72h可明顯降低地高辛在Caco-2單層細胞的滲透系數(shù)，同時增加其外排系數(shù)，此改變可被P-糖蛋白抑制劑環(huán)孢菌素所逆轉(zhuǎn)；另一方面，布格

11、呋喃100μM可抑制P-糖蛋白對地高辛的外排。以上結(jié)果提示，布格呋喃可誘導/抑制腸道P-糖蛋白功能。
　　 3.2布格呋喃多次口服可上調(diào)腎臟CYP2C11、2E1和P-糖蛋白的水平，并且對腎CYP2E1的上調(diào)倍數(shù)大于肝臟。
　　 四、布格呋喃與大鼠腦P-糖蛋白的相互作用4.1應(yīng)用大鼠原位腦灌流模型研究發(fā)現(xiàn)，布格呋喃在腦中的分布在0-8min內(nèi)呈線性增加；P-糖蛋白抑制劑環(huán)孢菌素可使布格呋喃自血液向腦組織的單向轉(zhuǎn)運明顯增加

12、，提示布格呋喃是腦P-糖蛋白的底物，血腦屏障中的P-糖蛋白可對布格呋喃腦分布產(chǎn)生阻礙作用。
　　 4.2應(yīng)用RT-PCR、westernblot和羅丹明腦-血分布方法檢測大鼠腦MDR1基因的mRNA和P-糖蛋白表達及功能發(fā)現(xiàn)，多次口服布格呋喃可上調(diào)P-糖蛋白表達和功能。
　　 五、布格呋喃對聯(lián)合用藥的藥代動力學影響研究5.1非那西丁為常用解熱鎮(zhèn)痛藥，體內(nèi)主要經(jīng)CYP1A2代謝生成代謝產(chǎn)物撲熱息痛。當布格呋喃與非那西丁聯(lián)合

13、用藥時，單次給予布格呋喃組非那西丁AUC、峰濃度升高，清除率下降，而其代謝產(chǎn)物撲熱息痛的AUC和達峰濃度均有所下降；多次給藥組非那西丁的AUC下降，MRT減小，而清除率提高，同時撲熱息痛的AUC和峰濃度均較對照組升高。以上結(jié)果與布格呋喃對肝臟CYP1A2的誘導/抑制相關(guān)。
　　 5.2氯唑沙宗是中樞性肌松劑，在體內(nèi)主要經(jīng)CYP2E1代謝。體內(nèi)藥代動力學結(jié)果表明，多次口服布格呋喃組氯唑沙宗的AUC下降，MRT減小，清除率提高，而6

14、-羥基氯唑沙宗的AUC和峰濃度均較對照組升高，提示布格呋喃多次給藥可在一定程度上加快氯唑沙宗的消除，可能與對肝臟CYP2E1的誘導密切相關(guān)。但單次給予布格呋喃組氯唑沙宗各藥代動力學參數(shù)無顯著性變化，說明布格呋喃單次口服對氯唑沙宗體內(nèi)過程影響不大。
　　 5.3咪達唑侖屬于苯二氮卓類鎮(zhèn)靜催眠藥，主要由CYP3A同工酶代謝，其清除率主要取決于CYP3A活性。大鼠體內(nèi)藥代動力學研究結(jié)果表明，口服布格呋喃后咪達唑侖達峰濃度提高，推測與前

15、述布格呋喃對CYP3A的體外抑制作用有關(guān)。而多次口服布格呋喃的大鼠表現(xiàn)為咪達唑侖體內(nèi)AUC、達峰濃度顯著降低，清除大大加快，但相應(yīng)體內(nèi)代謝產(chǎn)物也減少，提示其體內(nèi)代謝還有其它因素參與。據(jù)報道，咪達唑侖是CYP3A和P-糖蛋白共同的底物，布格呋喃多次給藥對小腸P-糖蛋白也有誘導作用，當兩藥合用時，布格呋喃可通過誘導P-糖蛋白減少咪達唑侖的吸收，導致其血藥濃度降低，同時代謝產(chǎn)物減少。
　　 5.4地高辛為一種中效強心苷，為P-糖蛋白的

16、底物，治療安全范圍較小，毒性反應(yīng)嚴重時會危及生命。前期研究表明，布格呋喃對P-糖蛋白有誘導/抑制作用，因此本文對二者合用時地高辛的血藥濃度進行了監(jiān)測。實驗結(jié)果表明，布格呋喃單次口服可明顯升高地高辛血藥濃度（峰濃度升高約25％，AUC升高85％），因此兩藥合用時，注意避免出現(xiàn)毒副作用。布格呋喃多次給藥可使地高辛達峰濃度和AUC分別降至對照組的70％和80％，提示在長期服用布格呋喃后使用其他P-糖蛋白的底物藥應(yīng)注意藥效學的監(jiān)控。綜上所述，本