DC-SIGN與Tollip的相互作用研究及靈芝孢子多糖成分的生物學(xué)活性探討.pdf

1、第一部分DC-SIGN與Tollip的相互作用研究
　　 DC-SIGN(Dendritie cell-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin)是C型凝集素受體超家族的成員,它主要在樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell,DC)表面表達(dá)。DC-SIGN是Ⅱ型跨膜受體,分為胞漿尾部、跨膜區(qū)以及胞外段三部分。DC-SIGN能夠通過其胞外段的碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域(carbohydrate recog

2、nition domain,CRD)以鈣離子依賴的方式去識別一些病原體表面或組織表面特異性的糖結(jié)構(gòu),比如HIV-1、結(jié)核桿菌表面的高甘露糖結(jié)構(gòu),結(jié)腸癌細(xì)胞表面的Lewix/y。DC-SIGN可以介導(dǎo)DC多方面的功能,比如參與DC的遷移,介導(dǎo)DC與T細(xì)胞的粘附和對T細(xì)胞的激活,捕獲病原體和抗原呈遞等。但是,DC-SIGN分子也存在不利于人體的一面。目前的研究發(fā)現(xiàn),DC-SIGN可以促進(jìn)一些病原體或腫瘤逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。比如,DC-SIG

3、N捕獲HIV-1以后,可將其內(nèi)化至細(xì)胞中的一個(gè)非溶酶體區(qū)域,保護(hù)HIV-1免受降解,并通過反式作用的方式促進(jìn)HIV-1對CD4+T細(xì)胞的感染;在識別結(jié)核桿菌細(xì)胞壁成分以后,DC-SIGN所產(chǎn)生的信號可以抑制DC的成熟,干擾Toll樣受體信號,促進(jìn)免疫抑制因子IL-10的表達(dá);DC-SIGN與CEA(earcinoembryonic antigen)表面的Lewisx/y抗原結(jié)合以后,可以誘導(dǎo)2型T輔助細(xì)胞反應(yīng),有利于腫瘤免疫逃避。DC-

4、SIGN與病原體或腫瘤免疫逃避的關(guān)系和機(jī)制的研究,將為人們治療相關(guān)疾病提供新的思路。
　　 目前,對于DC-SIGN的研究主要集中在其胞外段對病原體的識別方面,而DC-SIGN胞漿段的相關(guān)研究還很少。為此,本實(shí)驗(yàn)室以DC-SIGN的胞漿段為誘餌,在人的胸腺cDNA文庫中進(jìn)行酵母雙雜交并篩選到Tollip(Tollinteracting protein)這一基因。Tollip是IL-1/Toll樣受體信號通路中的信號分子,對于調(diào)節(jié)

5、炎癥反應(yīng)發(fā)揮一定的作用。Tollip在蛋白質(zhì)運(yùn)輸方面也發(fā)揮作用,比如介導(dǎo)內(nèi)化后的IL-1受體向溶酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)。通過GST-pulldown,免疫共沉淀,熒光共定位等方法,我們證實(shí)了Tollip和DC-SIGN胞漿段相互作用的存在,并且Tollip的C2結(jié)構(gòu)域,即57-164位氨基酸殘基對于該相互作用是必需的。我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),當(dāng)DC-SIGN內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞漿以后與Tollip存在著點(diǎn)狀共定位。并且,在表達(dá)57-164位氨基酸缺失的突變型To

6、llip的細(xì)胞中,DC-SIGN內(nèi)化進(jìn)入胞漿形成點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)的水平受到明顯的抑制。此外,用DC-SIGN特異性的抗體激活DC-SIGN信號通路以后,Tollip可以被酪氨酸磷酸化。我們的研究結(jié)果提示Tollip可能參與DC-SIGN內(nèi)化后在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn),同時(shí)也可能作為DC-SIGN信號通路中的潛在效應(yīng)分子。對于DC-SIGN與Tollip相互作用的研究的深入,將為進(jìn)一步闡明DC-SIGN介導(dǎo)病原體或腫瘤免疫逃避的分子機(jī)制提供新的線索。

7、>　　 第二部分靈芝孢子粉多糖成分GSG的生物學(xué)活性探討
　　 靈芝是(Ganoderma lucidum)擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌赤芝和紫芝的總稱,有扶正固本等功效,被《本經(jīng)》列為上品。靈芝孢子(Spores of Ganoderma lucidum)是由靈芝發(fā)育后期釋放出來的擔(dān)孢子。近年來,隨著孢子粉采集和破壁技術(shù)的提高,對靈芝孢子粉有了進(jìn)一步的認(rèn)識。藥理試驗(yàn)表明,靈芝孢子粉比靈芝子實(shí)體具有更強(qiáng)更全面的作用,它是靈芝的精

8、華部分,具有抑制腫瘤細(xì)胞生長,調(diào)節(jié)、提高人體免疫力,降低膽固醇,提高肌體耐缺氧能力等功能。靈芝孢子化學(xué)成分有蛋白質(zhì)、氨基酸類、多糖類和維生素類等多種成分。目前研究認(rèn)為,靈芝多糖類化合物是靈芝中主要的活性成分之一,國內(nèi)外已有報(bào)道指出從孢子粉中可提取出具免疫調(diào)節(jié)活性的多糖。
　　 中國科學(xué)院上海有機(jī)所通過水提、乙醇分級沉淀的方法,并通過采用DEAE-cellulose和SephadexG-50色譜柱分離純化,從靈芝破壁孢子粉中得到單

9、一級的多糖組分GSG(G.lucidum spores glucan)。經(jīng)過紅外、NMR以及GC-MS的分析,該多糖被鑒定為是以β(1→3)Glcp構(gòu)成主鏈,且Glc殘基在6-O處有分枝,側(cè)鏈由β(1→6)Glep、β(1→4)Glcp組成,由α(1→)Glcp構(gòu)成側(cè)鏈末端。通過HPGPC(High performance gel permeationchromatography)分析,GSG的分子量為5000～11000Da。因此GS

10、G是可溶性低分子量的β葡聚糖。我們在體外研究中發(fā)現(xiàn),GSG能夠刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的活化,引起活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生以及細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的分泌。并且,GSG刺激細(xì)胞因子的分泌是依賴于MAPK(mitogen-activated protein kinase)信號通路的,包括ERK、p38和JNK信號。通過表面胞質(zhì)團(tuán)能量共振以及流式細(xì)胞儀檢測技術(shù),我們證實(shí)GSG能夠被C型凝集素受

11、體Dectin-1所識別。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),GSG能夠部分通過Dectin-1行使其免疫激活效應(yīng)。在體內(nèi),GSG具有抗腫瘤活性以及增強(qiáng)ConA所誘發(fā)的小鼠脾臟細(xì)胞增殖反應(yīng)的功能。
　　 我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了從靈芝孢子中提取的β葡聚糖GSG在體內(nèi)和體外均具有生物學(xué)活性,并且GSG分子量低、水溶性好,跟一些大分子量的葡聚糖比如香菇多糖相比,更有利于人體吸收,降低抗原性。因此GSG具有很大的開發(fā)潛力。Dectin-1可能在介導(dǎo)GSG的免疫激