海洋生物天然活性成分與細(xì)胞的相互作用研究.pdf

1、從海洋生物中尋找和篩選具有藥用價(jià)值的活性先導(dǎo)化合物是藥物研發(fā)的一個(gè)重要趨勢。而海洋藥物研發(fā)的第一步就是活性成分的篩選。傳統(tǒng)的藥物篩選都是以抗菌實(shí)驗(yàn)、體外細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)考察藥物的生理作用，具有步驟繁瑣，要求高，時(shí)間長等缺點(diǎn)。本文根據(jù)海洋生物活性成分與腫瘤細(xì)胞相互作用的可能機(jī)理，建立了海洋藥物活性成分篩選的新方法。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴以已知生物活性的中藥為模式天然藥物，建立分析方法及活性測試方法，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究奠定

2、基礎(chǔ)。采用HPLC分別對(duì)紅花超純水提取物中的羥基紅花黃色素A以及延胡索超純水提取物中的延胡索乙素進(jìn)行了定性定量分析。在此基礎(chǔ)上，選用常見的人類HepG2肝癌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用CCK-8法探討了羥基紅花黃色素A（HSYA）及延胡索乙素體外對(duì)細(xì)胞活力的影響。HSYA和延胡索乙素作用于HepG2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果基本相符，證明該方法可用于天然生物活性成分的分離及活性測試。⑵使用HPLC-RID以及HPLC-MS聯(lián)用儀器，分別對(duì)13種

3、海洋天然生物的水提物中的物質(zhì)進(jìn)行探究。選取超純水和乙腈作為流動(dòng)相，采用RID檢測器與等度洗脫程序，對(duì)海洋生物提取物進(jìn)行分離，結(jié)果5種樣品檢測出峰，其中GG07和KG04分離效果良好。選取超純水和甲醇作為流動(dòng)相，采用質(zhì)譜法對(duì)海洋生物提取物中的進(jìn)行初步測定。結(jié)合HPLC與質(zhì)譜檢測結(jié)果，推測海洋生物提取物中應(yīng)該含有海洋多糖類物質(zhì)。⑶采用HPLC-MS法分析了殼聚糖樣品KG04、海綿提取物樣品HJ12中某一分子量成分與大腸桿菌及金黃色葡萄球菌相

4、互作用的特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，殼寡糖KG04中分子量為531的物質(zhì)和海綿提取物樣品HJ12中分子量為403的物質(zhì)與大腸桿菌細(xì)胞以及金黃色葡萄球菌相互作用的結(jié)合率均不高，隨濃度升高并無太大變化。采用HPLC-MS法分析了海綿提取物樣品HJ12中分子量為401和431與人類肝癌細(xì)胞HepG2相互作用的特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，海綿提取物樣品HJ12中分子量為403和海綿水提物中431的樣品與HepG2肝癌細(xì)胞相互作用前后的結(jié)合率隨樣品濃度的增大而增大。因此

5、，海綿提取物樣品 HJ12和海綿水提物可能會(huì)有促腫瘤凋亡或致死作用。⑷為驗(yàn)證海洋生物活性物質(zhì)與微生物間及與腫瘤細(xì)胞相互作用與抗菌活性、抗腫瘤之間關(guān)系，進(jìn)行了抗菌活性測試和抗腫瘤活性測試。根據(jù)抑菌試驗(yàn)結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)濃度下，12種海洋生物提取物與大腸桿菌及金黃色葡萄球菌作用24h后，培養(yǎng)皿上均沒有抑菌圈出現(xiàn)。選用CCK-8法及Annexin V-FTIC/PI流式細(xì)胞儀檢測法探究了海綿提取物樣品HJ12中分子量為403和海綿水提物中431的樣

6、品對(duì)HepG2腫瘤細(xì)胞活性影響，發(fā)現(xiàn)隨海綿水提物濃度的增加，HepG2肝癌細(xì)胞的凋亡率逐漸升高。早期凋亡及晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)量都表現(xiàn)出良好的一致性，說明這兩種活性物質(zhì)可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入凋亡模式。與第三章中的結(jié)合率實(shí)驗(yàn)相比，活性物質(zhì)與腫瘤細(xì)胞間的結(jié)合率越高，表現(xiàn)出的促凋亡作用越明顯。⑸紅藻寡糖樣品QJ03、異麥芽寡糖樣品YM06、珊瑚提取物樣品SS10和珊瑚提取物樣品SM11在實(shí)驗(yàn)濃度作用下，正常細(xì)胞群與凋亡細(xì)胞群數(shù)量并未發(fā)生明顯改變，無

7、增殖現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡率維持在穩(wěn)定的低水平，說明QJ03、YM06、SS10和SM11對(duì)細(xì)胞無明顯作用。紅藻寡糖樣品KL02在實(shí)驗(yàn)濃度作用下，細(xì)胞凋亡率明顯有所增加，但是細(xì)胞的凋亡率先減少后增加，原因有待進(jìn)一步研究。褐藻寡糖樣品HZ01、殼寡糖樣品KG04、木寡糖樣品MG05、果寡糖樣品GG07、海馬提取物樣品SB08、海馬提取物樣品CC09、海綿提取物樣品 HJ12和海綿水提物在實(shí)驗(yàn)濃度作用下，細(xì)胞的凋亡率有所提高。而且，隨濃度的提高，H