實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大腸癌病人循環(huán)腫瘤細(xì)胞中EpCAM,ALDH1,Ki67mRNA的表達(dá)及意義.pdf

1、目的：用分子生物學(xué)方法分析大腸癌病人循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)中腫瘤干細(xì)胞(CSC)標(biāo)志ALDH1、EpCAM的表達(dá)及增殖標(biāo)志Ki67的表達(dá)，為大腸癌微轉(zhuǎn)移的早期診斷和準(zhǔn)確分期提供有價(jià)值的信息。
　　 方法：使用RT-PCR的方法從培養(yǎng)的細(xì)胞（SW620和Sup-B15細(xì)胞株）中獲取EpCAM、ALDH1及Ki67基因目的片段，將目的片段分別插入pGEM-T載體，構(gòu)建三個(gè)質(zhì)粒pGEM-T-EpCAM、pGEM-T-ALDH1和pGE

2、M-T-Ki67作為熒光定量PCR檢測(cè)的陽性標(biāo)準(zhǔn)模板；將克隆的陽性標(biāo)準(zhǔn)模板分別按108、107、106、105、104、103copies/μl梯度稀釋，制作熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　 收集56例經(jīng)病理確診的結(jié)直腸癌病人術(shù)前外周靜脈血7ml，56例健康志愿者做陰性對(duì)照組，從全血中提取單個(gè)核細(xì)胞的總RNA。規(guī)定取400ng總RNA加入20μl反轉(zhuǎn)錄體系反轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后用熒光定量PCR Taqman探針法檢測(cè)各個(gè)樣本中三

3、個(gè)目的基因EpCAM、ALDH1、Ki67mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：1）大腸癌病人組EpCAM、ALDH1、Ki67mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P＜0.005);2)ALDH1水平與腫瘤浸潤(rùn)程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，EpCAM水平與TNM分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　 結(jié)論：分子生物學(xué)方法檢測(cè)大腸癌病人CTC中EpCAM、ALDH1、Ki67mRNA的表達(dá)：1）有可能成為一種簡(jiǎn)便可行的早期檢測(cè)大腸癌微轉(zhuǎn)移的方法；2）為結(jié)直腸