影響豬ICSI轉(zhuǎn)基因效率主要因素的研究.pdf

1、本試驗(yàn)以豬體外成熟卵子和冷凍解凍的死精子為材料，探討了豬ICSI轉(zhuǎn)基因效率的主要影響因素。其中包括注射臺(tái)溫度(30℃，38.5℃)、精子與GFP質(zhì)粒孵育液溫度(4℃，24℃，39℃)、激活后6-DMAP的處理、BSA(牛血清白蛋白)、GFP質(zhì)粒的濃度及結(jié)構(gòu)(線形和環(huán)形)和GFP不同的表達(dá)載體，并對(duì)綠色熒光胚胎做了PCR檢測(cè)。 結(jié)果表明，注射臺(tái)溫度為30℃時(shí)的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率為40.07％，而38.5℃時(shí)為20.97％，差異極顯著(p

2、＜0.01)；但囊胚率差異不顯著(p＞0.05)。精子與GFP的孵育溫度(4℃，24℃，39℃)對(duì)轉(zhuǎn)基因效率和囊胚率的影響不顯著(p＞0.05)，但隨著孵育溫度升高，轉(zhuǎn)基因率有降低的趨勢(shì)。精子與GFP孵育時(shí)，GFP濃度為0.01μg/μl的轉(zhuǎn)基因率(21.13％)比濃度為0.05μg/μl(50.20％)和0.1μg/μl(48.79％)的轉(zhuǎn)基因率低，差異顯著(p＜0.05)，但濃度為0.05μg/μl和0.1μg/μl的轉(zhuǎn)基因率沒(méi)有顯

3、著差異，而且3個(gè)濃度的囊胚率也沒(méi)有顯著差異(p＞0.05)。環(huán)形GFP的轉(zhuǎn)基因率為28.62％，線形的為40.18％，差異顯著(p＜0.05)，但二者的囊胚率沒(méi)有顯著差異。pEGFP-N1和pbCASEGFP-LGL的轉(zhuǎn)基因效率和囊胚率都沒(méi)有顯著差異(p＞0.05)。精子與GFP質(zhì)粒孵育液添加BSA(0.3％)轉(zhuǎn)基因率和囊胚率差異不顯著(p＞0.05)；但添加BSA的囊胚轉(zhuǎn)基因率為55.56％，而對(duì)照組為33.33％，差異極顯著(p＜0

4、.01)。6-DMAP處理組與對(duì)照組的轉(zhuǎn)基因率分別為52.53％和26.25％，差異極顯著(p＜0.01)；而且6-DMAP處理組的囊胚率(9.96％)顯著比對(duì)照組(2.30％)高(p＜0.05)。PCR結(jié)果顯示綠色熒光胚胎的擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度大概為800bp，與用pEGFP-N1質(zhì)粒的擴(kuò)增產(chǎn)物相近，說(shuō)明這些胚胎攜帶了EGFP基因。 研究表明注射臺(tái)溫度對(duì)轉(zhuǎn)基因效率有明顯影響，溫度高轉(zhuǎn)基因率低；隨著精子與GFP孵育溫度的升高，轉(zhuǎn)基因率有