以羊膜為載體培養(yǎng)口腔粘膜上皮在眼表重建中的應用.pdf

1、角膜緣干細胞位于角膜緣基底層，是角膜上皮細胞分化和增殖的來源。眼部化學傷、熱燒傷、Stevens-Johnson綜合征(Stevens-Johnsonsyndrome，SJS)等多種病因可引起角膜緣干細胞缺乏(limbalstemcelldeficiency,LSCD)，臨床表現(xiàn)以角膜結膜化、新生血管、基質瘢痕化等為特征，最終導致角膜混濁、潰瘍、穿孔，甚至視力喪失。對于此類由角膜緣干細胞缺乏導致的嚴重眼表疾病(ocularsurface

2、disease，OSD)，眼表重建(ocularsurfacereconstruction，OSR)為首選的治療，但常規(guī)手術方法療效欠佳。結膜移植術后出現(xiàn)大量角膜基質新生血管，且結膜組織透明度低，影響患者視力及外觀。羊膜移植術后眼表上皮為結膜表型，且對于嚴重干眼、彌漫性上皮角化和角膜緣缺血等患者療效甚微。自體角膜上皮移植(角膜上皮移植術和角膜緣移植術)僅能治療單眼發(fā)病患者，異體角膜緣干細胞移植術后存在排斥反應，影響植片長期存活。隨著生物

3、工程及再生醫(yī)學的發(fā)展，人們嘗試使用體外培養(yǎng)非角膜上皮來源的復層非角化上皮細胞移植片自體移植進行眼表重建。本課題目的在于制備兔角膜緣干細胞衰竭模型，觀察以脫細胞羊膜為載體體外培養(yǎng)的人口腔粘膜上皮移植片用于眼表重建的療效及可行性，為人口腔粘膜自體移植提供理論和實驗依據。 第一章：目的1.探索體外培養(yǎng)人口腔粘膜上皮細胞的方法。2.體外培養(yǎng)人口腔粘膜上皮細胞的鑒定。方法取供體口腔頰部粘膜上皮組織制備成單細胞懸液，以脫細胞羊膜為載體、3T

4、3成纖維細胞為飼養(yǎng)層，采用氣—液相培養(yǎng)方法構建移植片。培養(yǎng)后期對口腔粘膜上皮細胞移植片進行形態(tài)學觀察及免疫組化染色以鑒定移植片上皮細胞的表型。結果以羊膜為載體體外培養(yǎng)的人口腔粘膜上皮細胞為排列整齊的復層上皮，細胞結構完整，組織學上類似正常人角膜上皮。免疫組化結果顯示，正常及體外培養(yǎng)的人口腔粘膜上皮均表達角蛋白K3、K4、K13，角蛋白K10表達陰性。結論1.人口腔粘膜上皮為復層非角化上皮細胞，生物學特性與正常人角膜上皮相似，且分化程度低

5、、更新周期短，可作為角膜上皮移植替代物。2.脫細胞羊膜結構穩(wěn)定、抗原性低，可作為體外培養(yǎng)人口腔粘膜上皮細胞的良好載體。3.采用3T3成纖維細胞為飼養(yǎng)層，氣—液相體外培養(yǎng)人口腔粘膜上皮，細胞復層排列整齊，可分化為角膜樣上皮細胞。4.體外培養(yǎng)的人口腔粘膜上皮細胞與脫細胞羊膜貼附緊密，構建的口腔粘膜上皮移植片結構穩(wěn)定。 第二章：目的1.探討使用體外培養(yǎng)人口腔粘膜上皮移植重建眼表的方法。2.評價體外培養(yǎng)口腔粘膜上皮移植在眼表重建中的價值

6、。方法采用環(huán)形板層切除法制備單眼兔角膜緣干細胞衰竭模型，3-4周后行口腔粘膜上皮片移植術重建眼表。術中刮除兔角膜面增生的結膜化組織及新生血管膜，將體外構建的人口腔粘膜上皮移植片平鋪于角膜創(chuàng)面，角膜緣處縫線間斷縫合。術后每日行裂隙燈檢查，觀察移植片的存活狀況及眼表的穩(wěn)定性。術后1月取兔角膜組織進行組織學切片和免疫組化染色明確上皮來源。結果制備角膜緣干細胞衰竭模型術后，1只兔因術眼感染自然死亡；余9只兔術眼出現(xiàn)角膜結膜化、新生血管及角膜混濁

7、等角膜緣干細胞缺乏表現(xiàn)。7只兔行眼表重建術后，6只兔植片存活情況良好，1％熒光素鈉染色陰性，角膜透明度較術前不同程度提高，移植片下方見新生血管增殖，局限于角膜周邊區(qū)；1只白兔因術后3天羊膜脫落更換移植片，二次術后植片存活良好，角膜透明程度提高。術后1月角膜HE染色見復層上皮細胞排列緊密，免疫組化結果角蛋白K3、K4、K13表達陽性。結論1.體外培養(yǎng)的人口腔粘膜上皮移植重建兔眼表后，移植片上皮細胞排列與正常人角膜上皮類似，免疫組化染色證實