CaMKII可變剪接異構(gòu)體在β1腎上腺素受體通路的持久興奮導(dǎo)致的心力衰竭中表達(dá)、功能及干預(yù)機(jī)制.pdf

1、研究背景和目的:大量研究表明短期興奮β1腎上腺素受體激活 G(s)–腺苷環(huán)化酶-cAMP-PKA信號通路。然而β1腎上腺素受體長期興奮可心肌細(xì)胞肥大和凋亡,而且這些效應(yīng)與經(jīng)典的cAMP/PKA通路不同,它表現(xiàn)為PKA的脫敏,轉(zhuǎn)為對Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶(CaMKII)的激活。CaMKII尤多異構(gòu)體,CaMKIIδ是心臟中表達(dá)的主要異構(gòu)體,CaMKIIδ兩個(gè)主要剪接異構(gòu)體δB和δC,它們在心肌肥厚和心力衰竭中可能發(fā)揮不同作用,因

2、此值得深入研究。過度表達(dá)δc的轉(zhuǎn)基因鼠心肌收縮功能明顯下降,理阿諾堿受體2(RyR2)磷酸化增加,心室明顯擴(kuò)張,最終發(fā)生心力衰竭,提示CaMKIIδ參與心力衰竭發(fā)生發(fā)展過程。研究證明,在壓力超負(fù)荷(TAC)的動物心肌中只有δC表達(dá),并且在TAC后7天時(shí)仍繼續(xù)升高。還有研究表明,刺激β1-腎上腺素能受體(AR)激活可以激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號途徑,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種功能活動。MAPKs家族由一系列蛋白激酶組成,其中三個(gè)重要的

3、成員是:細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶( ERK),c-Jun氨基端激酶(JNK)和p38 MAPK。JNK和p38是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白激酶,ERK具有抗細(xì)胞凋亡的作用。CaMKII可以活化 p38 MAPK上調(diào)促凋亡蛋白Bax和下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2引起心肌細(xì)胞凋亡。另有研究證實(shí)應(yīng)激通過p38 MAPK誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白(CHOP)、半胱氨酸蛋白酶caspase-12活化及磷酸化刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERs)及其相關(guān)凋亡基因。那么β1腎上

4、腺素受體持久興奮通過激活 CaMKIIδC導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制是什么。MAPKs家族基因和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路在其中所起的作用是什么?這些均有待研究闡明。我們假設(shè)持久興奮β1腎上腺素受體激活可以激活 CaMKIIδC及 MAPKs家族中p38MAPK活化,并進(jìn)一步引起心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡,最終導(dǎo)致心力衰竭。為了證明這一假說,我們建立了異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心衰模型,同時(shí)我們用β1腎上腺素受體阻斷劑美托洛爾干預(yù),來研究CaM

5、KIIδ異構(gòu)體、MAPKs家族和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在β1腎上腺素受體持久激活導(dǎo)致心力衰竭發(fā)生、發(fā)展過程的作用。通過本項(xiàng)目研究將能為研究和制定通過干預(yù)β1-AR持久激活阻斷心肌損傷的機(jī)制研究預(yù)防和治療心力衰竭的新的策略和措施提供理論依據(jù)。
　　方法:40只SD大鼠隨機(jī)分成四組,正常對照組(Control)、異丙腎上腺組(Iso)、異丙腎上腺+美托洛爾組(Iso+Met)和美托洛爾組(Met),每組10只,所有動物均自由進(jìn)食進(jìn)水。(1)異丙腎

6、上腺組(Iso)大鼠背部皮下注射 Iso5mg/(kg/d),連續(xù)10d;對照組背部皮下注射相同體積的生理鹽水;異丙腎上腺+美托洛爾組大鼠背部皮下注射Iso5mg/(kg/d),連續(xù)10d,在背部皮下注射Iso前日開始美托洛爾10mg/(kg/d)連續(xù)4周灌胃;美托洛爾組給予10mg/(kg/d),連續(xù)4周灌胃。(2)所有大鼠飼養(yǎng)4周后,采用美國Millar公司P-V Loop導(dǎo)管經(jīng)頸動脈插管至左心室,使用Powerlab生理記錄系統(tǒng)測

7、量血流動力學(xué)相關(guān)指標(biāo);(3)酶聯(lián)免疫(ElISA)分析大鼠鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶II活性,TUNEL法和Caspase3活性檢測心肌細(xì)胞凋亡;(4)為研究CaMKIIδ不同剪接體在心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的作用,我們采用人工合成多肽抗原多次免疫法免疫家兔制備 CaMKⅡδB和 C不同剪接體特異性多肽抗體,ElISA法證明抗體滴度,用辛酸-硫酸銨法純化抗體,十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(12％SDS-PAGE)電泳考馬斯藍(lán)檢測抗體純度。并經(jīng)

8、 Western Blot檢測心肌中不同異構(gòu)體的表達(dá)水平。(5)經(jīng)免疫組化和Western雜交分析檢測MAPKs家族(p-38、 JNK、 ERK)、ERS相關(guān)基因(GRP78、CHOP、caspase-12)、細(xì)胞生存相關(guān)基因 PI3K、Akt和凋亡相關(guān)基因Bcl-2/Bax的表達(dá)水平和磷酸化水平。
　　結(jié)果:40只SD大鼠實(shí)驗(yàn)過程精神狀態(tài)好,進(jìn)食進(jìn)水正常,無呼吸困難及水腫。(1)異丙腎上腺素和美托洛爾干預(yù)SD大鼠心臟重塑和血流

9、動力學(xué)指標(biāo)有顯著改變,異丙腎上腺素組心臟重量和心臟重量指數(shù)和正常對照組相比有顯著性差異(P<0.05);但異丙腎+美托洛爾組心臟重量和心臟重量指數(shù)明顯低于異丙腎上腺素組(P<0.05);大鼠體重、肝重和肺重四組間也無明顯差異。大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)心率(HR)、平均動脈血壓(MBP)和左室舒張末壓(LVEDP)異丙腎上腺素組明顯高于正常對照組;但左室壓力變化速率(LV dp/dt)異丙腎上腺素組明顯低于正常對照組(P<0.05);而異丙腎+

10、美托洛爾組HR、MBP和LVEDP明顯低于異丙腎上腺素組(P<0.05),但異丙腎+美托洛爾組LV dp/dt明顯高于異丙腎上腺素組(P<0.05)。(2)異丙腎上腺素組 SD大鼠心肌細(xì)胞 TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)和 Caspase-3活性明顯高于正常對照組(P<0.05);Western雜交分析檢測異丙腎上腺素組抗凋亡蛋白bcl-2表達(dá)明顯低于正常對照組(P<0.05),而促抗凋亡蛋白Bax表達(dá)明顯高于正常對照組。CaMKII活性分析結(jié)果

11、顯示異丙腎上腺素組明顯高于正常對照組(P<0.05)。說明異丙腎上腺素誘導(dǎo)了明顯的心肌細(xì)胞凋亡,并且心肌細(xì)胞凋亡和 CaMKII活性明顯正相關(guān)。(3)我們采用人工合成多肽抗原多次免疫法免疫家兔制備CaMKⅡδB和C不同剪接體特異性多肽抗體, ELISA證明抗體滴度均達(dá)到12800以上,12%SDS-PAGE)電泳考馬斯藍(lán)檢測抗體純度好。(4)CaMKIIδ異構(gòu)體、MAPKs家族和ERs相關(guān)基因在β1腎上腺素受體持久興奮的SD大鼠心肌表達(dá)

12、情況,我們用Western blot方法分析結(jié)果顯示異丙腎上腺素組CaMKIIδC和p-CaMKIIδ、p38 MAPK、JNK、GRP78、CHOP和Cleaved caspase-12蛋白表達(dá)明顯高于正常對照組(P<0.05),但β1腎上腺素受體阻滯劑美托洛爾可阻斷上述過程。而異丙腎上腺素組ERK和PI3K/Akt蛋白表達(dá)明顯低于正常對照組(P<0.05)。
　　結(jié)論:(1)β1腎上腺素受體持久興奮激活CaMKIIδ通路,Ca

13、MKIIδC剪接異構(gòu)體是β1腎上腺素受體信號通路持久激活誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的主要成分。(2)β1腎上腺素受體通路持久興奮激活CaMKIIδ通路和MAPKs家族信號分子,并進(jìn)一步誘導(dǎo)ER應(yīng)激,促進(jìn)凋亡,最終導(dǎo)致心肌重構(gòu)、心力衰竭。(3)β受體阻滯劑美托洛爾可阻斷β1腎上腺素受體持久激活-CaMKIIδ-MAPKs-ER應(yīng)激-細(xì)胞凋亡途徑,對心臟有保護(hù)效應(yīng)。(4)針對CaMKIIδC的干預(yù)β1腎上腺素受體持久興奮阻斷心肌損傷的機(jī)制研究為預(yù)防和