荔枝花序上雛形葉衰老機(jī)理的研究.pdf

1、荔枝（Litchi chinensisSonn.）作為一種重要的熱帶、亞熱帶常綠果樹，有著非常重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而，在荔枝的成花過程中，由于受到外界環(huán)境及樹體自身因素的綜合影響，容易導(dǎo)致荔枝產(chǎn)量不穩(wěn)定，嚴(yán)重制約著荔枝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。荔枝成花質(zhì)量不佳、花序發(fā)育不良是荔枝產(chǎn)量不穩(wěn)的主要原因之一。本研究從荔枝花序上雛形葉對花序發(fā)育的影響作為切入點(diǎn)，研究了‘糯米糍’與‘桂味’兩個(gè)荔枝品種在花序發(fā)育過程中，雛形葉發(fā)育與否對最終成花的影響。通過活性氧（

2、ROS，Reactive oxygen species）處理研究‘糯米糍’花序上雛形葉衰老機(jī)理。以不同衰老階段的雛形葉進(jìn)行高通量測序，通過分析表達(dá)譜及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得了NAC及Metacaspase等與葉片衰老相關(guān)的候選基因，并利用VIGS（Virus induced gene silencing）及異源遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)對這些基因進(jìn)行功能研究。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　?。?）通過生物學(xué)調(diào)查，研究荔枝‘糯米糍’和‘桂味’品種花序上雛

3、形葉發(fā)育與否對于花序生長的影響。根據(jù)不同品種花序上雛形葉對ROS及溫度響應(yīng)的差異，選擇‘糯米糍’與‘桂味’進(jìn)行成花和坐果的調(diào)查。結(jié)果表明，‘糯米糍’花序上的雛形葉對于甲基紫精（methyl viologen dichloride hydrate，MV）誘導(dǎo)的活性氧（ROS）及低溫信號(hào)敏感，在 ROS脅迫及低溫誘導(dǎo)下易發(fā)生提早衰老，使得花序繼續(xù)發(fā)育，反之則雛形葉正常發(fā)育，花序萎縮甚至不發(fā)育?！鹞丁ㄐ蛏想r形葉對于外源ROS及溫度信號(hào)的響

4、應(yīng)程度弱于‘糯米糍’，花序上的雛形葉與花序可以同步發(fā)育。對2014-2015年度的田間成花情況調(diào)查顯示，雛形葉的存在嚴(yán)重影響了‘糯米糍’花序的正常發(fā)育，而對于?桂味?則無明顯差異。利用人工溫室控溫，分別設(shè)置低溫（18/15℃）及高溫（28/25℃）環(huán)境，選擇‘糯米糍’和‘桂味’盆栽荔枝，經(jīng)過田間低溫誘導(dǎo)出現(xiàn)“白點(diǎn)”后轉(zhuǎn)入溫室生長。成花情況調(diào)查表明，‘糯米糍’花序上的雛形葉在高溫環(huán)境下正常發(fā)育，低溫環(huán)境下進(jìn)入衰老狀態(tài)，而‘桂味’則無顯著影

5、響。
　?。?）在控溫條件下，選擇經(jīng)過低溫誘導(dǎo)出現(xiàn)“白點(diǎn)”的‘糯米糍’盆栽荔枝，分別放入低溫（18/15℃）及高溫（28/25℃）溫室處理獲得不同發(fā)育方向的雛形葉和花序，對高溫下發(fā)育的雛形葉和萎縮的花序，以及低溫下發(fā)育的花序和衰老的雛形葉進(jìn)行表達(dá)譜測序分析。分析測序數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，多個(gè)差異表達(dá)基因?qū)儆贜AC類轉(zhuǎn)錄因子基因家族。對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分類統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，葉片樣品之間的顯著差異基因主要富集在代謝過程（metabolic proc

6、ess）、細(xì)胞過程（cellular process）、蛋白代謝過程（protein metabolic process）等方面；而花芽樣品中，顯著差異基因主要富集在結(jié)合（binding）、細(xì)胞（cell）、代謝過程（metabolic process）等方面。
　　（3）克隆獲得了荔枝LcNAC5、LcNAC4及LcNAP1全長基因序列，NCBI比對結(jié)果表明它們均屬于NAM超級(jí)家族。通過同源比對及構(gòu)建進(jìn)化樹分析了LcNAC5，L

7、cNAC4及LcNAP1與其他植物NAC的同源關(guān)系。同時(shí)，在MV誘導(dǎo)的荔枝雛形葉衰老過程中，LcNAC5、LcNAC4及LcNAP1的相對表達(dá)量呈上升趨勢。通過遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥及煙草，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的葉片在 MV誘導(dǎo)的衰老過程中，過表達(dá) LcNAC5、LcNAC4及LcNAP1的葉片衰老速度均快于對照葉片，表明在 ROS誘導(dǎo)下過表達(dá)LcNAC5，LcNAC4及LcNAP1可以加快葉片衰老進(jìn)程。
　?。?）選取LcNAC5為研究對象，利用

8、VIGS技術(shù)研究其在荔枝雛形葉衰老過程中的作用。通過VIGS技術(shù)沉默荔枝雛形葉中的LcNAC5，利用MV誘導(dǎo)雛形葉進(jìn)入衰老階段，發(fā)現(xiàn)沉默樣本的衰老速度遲緩于對照，且LcNAC5相對表達(dá)量顯著低于對照，表明該基因在一定程度上被沉默。同時(shí)選取了MV處理后30 h的對照葉片與VIGS處理葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，獲得了與LcNAC5沉默過程相關(guān)聯(lián)的其他差異表達(dá)基因，其中下調(diào)表達(dá)基因733個(gè)，上調(diào)表達(dá)基因1857個(gè)。
　　（5）克隆獲得了L

9、cMCⅡ-1，RT-qPCR分析結(jié)果表明，該基因在ROS及低溫誘導(dǎo)的荔枝雛形葉衰老過程中均呈現(xiàn)出上升趨勢。對荔枝自然衰老過程的葉片進(jìn)行定量分析表明，該基因也參與了荔枝葉片自然衰老過程。利用VIGS技術(shù)，在盆栽‘糯米糍’荔枝植株上進(jìn)行LcMCⅡ-1沉默處理，發(fā)現(xiàn)沉默處理的雛形葉對ROS誘導(dǎo)的衰老表現(xiàn)遲緩，表明LcMCⅡ-1參與了荔枝雛形葉衰老過程。通過遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥，對陽性苗的離體葉片進(jìn)行ROS處理發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)植株葉片表現(xiàn)出提早衰老的現(xiàn)象