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文檔簡(jiǎn)介
1、古樹壽命長(zhǎng)達(dá)幾千年仍不見衰老,其生理與分子調(diào)控機(jī)制如何?成為近年來植物抗衰老研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一;而活性氧(ROS)的動(dòng)態(tài)平衡被認(rèn)為是影響植物衰老的主要因素之一。本文2010年以陜西黃帝陵樹齡為20yr和3000yr側(cè)柏(Platycladus orientalis)葉片為研究材料,在對(duì)ROS生成與清除機(jī)制研究的基礎(chǔ)上,通過Solexa高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜測(cè)序分析,發(fā)掘與樹齡相關(guān)的差異表達(dá)功能基因;并應(yīng)用實(shí)時(shí)定量qRT-PCR
2、技術(shù),集中研究ROS動(dòng)態(tài)平衡相關(guān)基因在側(cè)柏幼苗受到NaCl、ABA脅迫時(shí)基因表達(dá)模式的變化情況,從而探討ROS清除機(jī)制在側(cè)柏抗衰老機(jī)制中的貢獻(xiàn)。主要結(jié)論如下:
?。?)通過對(duì)20yr和3000yr側(cè)柏H2O2和相關(guān)清除系統(tǒng)研究表明,3000yr側(cè)柏葉片H2O2含量在生長(zhǎng)季中高于20yr,而季末低于20yr;但3000yr側(cè)柏谷胱氨酸還原酶(GR)活性及谷胱甘肽(GSH)含量在季中明顯高于20yr側(cè)柏,而超氧化物歧化酶(SOD)活
3、性及抗壞血酸(AsA)含量基本沒有變化;同樣,3000yr側(cè)柏在季末的ROS清除能力高于20yr。另外,研究還發(fā)現(xiàn)3000yr側(cè)柏種子萌發(fā)過程中仍具有較高的ROS清除能力。結(jié)果說明,3000yr側(cè)柏可通過較高水平的H2O2清除能力使細(xì)胞免受或減輕傷害,這可能是其抗衰老的主要生理機(jī)制之一。
?。?)采用Solexa測(cè)序技術(shù)對(duì)20yr和3000yr側(cè)柏葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,總共進(jìn)行了13,600,516次讀數(shù),經(jīng)組裝得到363,885
4、個(gè)Contig,68,219個(gè)獨(dú)立的Scaffold;進(jìn)一步拼接后共獲得51,664個(gè)Unigene,平均長(zhǎng)度為475 bp。另外,通過對(duì)側(cè)柏葉片轉(zhuǎn)錄組中進(jìn)行SSR位點(diǎn)的發(fā)掘,發(fā)現(xiàn)了含SSRs的序列703條,共742個(gè)SSRs,SSRs出現(xiàn)的頻率為1.36%。這些Unigene對(duì)側(cè)柏進(jìn)行抗衰老研究提供了重要基因資源。
?。?)選擇10個(gè)側(cè)柏候選內(nèi)參基因,通過qRT-PCR分析其在不同樹齡、不同組織、不同脅迫(ABA、NaCl、P
5、EG、冷、熱脅迫)時(shí)基因表達(dá)變化,利用Ct值通過geNorm、NormFiner和BestKeeper軟件分析這些內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果表明:UBC和aTUB在不同樹齡、不同組織、不同處理表達(dá)穩(wěn)定。
?。?)在轉(zhuǎn)錄組序列的基礎(chǔ)上,利用Solex技術(shù)對(duì)20yr與3000yr側(cè)柏葉片建立差異表達(dá)譜。通過嚴(yán)格篩選,發(fā)現(xiàn)在3000yr VS20yr側(cè)柏中滿足FDR≤0.001,而|log2Ratio|≥1的差異表達(dá)基因共有1202個(gè)
6、,其中上調(diào)基因578個(gè),下調(diào)基因624個(gè)。并利用qRT-PCR對(duì)12個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行表達(dá)模式驗(yàn)證,結(jié)果與表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果基本一致。然后,根據(jù)功能對(duì)不同樹齡差異基因進(jìn)行分類,依次分為:信號(hào)傳導(dǎo)、激素、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白質(zhì)降解、ROS清除、衰老相關(guān)、脅迫響應(yīng)與抗逆、次生代謝、其它代謝、未知或預(yù)測(cè)蛋白等類別,這些基因可能使3000yr側(cè)柏通過調(diào)節(jié)體內(nèi)生理生化變化來抵御各種逆境。
?。?)通過對(duì) ROS清除相關(guān)基因 NAC、NQO、POD、
7、DXS、PAL、GAD、SSADH、GABA-T、TDB、TRF1在外源ABA、NaCl脅迫下基因表達(dá)分析表明,除SSADH在NaCl和TRF1在ABA脅迫下表現(xiàn)為基因表達(dá)水平先受到明顯抑制,隨后逐漸增強(qiáng);其余基因則是隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng),基因表達(dá)水平先明顯升高,后逐漸降低或保持較高水平,并且與H2O2含量成正相關(guān)關(guān)系,表明這些基因可能在側(cè)柏脅迫響應(yīng)過程中對(duì)ROS動(dòng)態(tài)平衡起到調(diào)控作用,從而間接說明這些基因可能在側(cè)柏古樹ROS清除機(jī)制中具有重
8、要作用。
綜上所述,本研究在不同樹齡側(cè)柏ROS清除系統(tǒng)測(cè)定分析的基礎(chǔ)上,首次利用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)側(cè)柏葉片的轉(zhuǎn)錄組及不同樹齡的表達(dá)譜進(jìn)行測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子、ROS清除、抗逆、次生代謝等差異表達(dá)基因中,3000yr側(cè)柏中有許多相關(guān)基因的表達(dá)量高于20yr側(cè)柏,說明這些基因?qū)?000yr側(cè)柏抗衰老機(jī)制具有重要作用;并通過集中分析ROS動(dòng)態(tài)平衡相關(guān)基因在脅迫響應(yīng)中表達(dá)模式變化,探討ROS調(diào)控對(duì)側(cè)柏抗衰老分子
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