側柏古樹抗衰老分子機理研究.pdf

1、古樹壽命長達幾千年仍不見衰老，其生理與分子調控機制如何？成為近年來植物抗衰老研究領域的熱點之一；而活性氧（ROS）的動態(tài)平衡被認為是影響植物衰老的主要因素之一。本文2010年以陜西黃帝陵樹齡為20yr和3000yr側柏（Platycladus orientalis）葉片為研究材料，在對ROS生成與清除機制研究的基礎上，通過Solexa高通量測序技術進行轉錄組和表達譜測序分析，發(fā)掘與樹齡相關的差異表達功能基因；并應用實時定量qRT-PCR

2、技術，集中研究ROS動態(tài)平衡相關基因在側柏幼苗受到NaCl、ABA脅迫時基因表達模式的變化情況，從而探討ROS清除機制在側柏抗衰老機制中的貢獻。主要結論如下：
　?。?）通過對20yr和3000yr側柏H2O2和相關清除系統(tǒng)研究表明，3000yr側柏葉片H2O2含量在生長季中高于20yr，而季末低于20yr；但3000yr側柏谷胱氨酸還原酶（GR）活性及谷胱甘肽（GSH）含量在季中明顯高于20yr側柏，而超氧化物歧化酶（SOD）活

3、性及抗壞血酸（AsA）含量基本沒有變化；同樣，3000yr側柏在季末的ROS清除能力高于20yr。另外，研究還發(fā)現(xiàn)3000yr側柏種子萌發(fā)過程中仍具有較高的ROS清除能力。結果說明，3000yr側柏可通過較高水平的H2O2清除能力使細胞免受或減輕傷害，這可能是其抗衰老的主要生理機制之一。
　?。?）采用Solexa測序技術對20yr和3000yr側柏葉片進行轉錄組測序，總共進行了13,600,516次讀數(shù)，經(jīng)組裝得到363,885

4、個Contig，68,219個獨立的Scaffold；進一步拼接后共獲得51,664個Unigene，平均長度為475 bp。另外，通過對側柏葉片轉錄組中進行SSR位點的發(fā)掘，發(fā)現(xiàn)了含SSRs的序列703條，共742個SSRs，SSRs出現(xiàn)的頻率為1.36％。這些Unigene對側柏進行抗衰老研究提供了重要基因資源。
　?。?）選擇10個側柏候選內參基因，通過qRT-PCR分析其在不同樹齡、不同組織、不同脅迫（ABA、NaCl、P

5、EG、冷、熱脅迫）時基因表達變化，利用Ct值通過geNorm、NormFiner和BestKeeper軟件分析這些內參基因的表達穩(wěn)定性。結果表明：UBC和aTUB在不同樹齡、不同組織、不同處理表達穩(wěn)定。
　　（4）在轉錄組序列的基礎上，利用Solex技術對20yr與3000yr側柏葉片建立差異表達譜。通過嚴格篩選，發(fā)現(xiàn)在3000yr VS20yr側柏中滿足FDR≤0.001，而|log2Ratio|≥1的差異表達基因共有1202個

6、，其中上調基因578個，下調基因624個。并利用qRT-PCR對12個差異表達基因進行表達模式驗證，結果與表達譜測序結果基本一致。然后，根據(jù)功能對不同樹齡差異基因進行分類，依次分為：信號傳導、激素、轉錄因子、蛋白質降解、ROS清除、衰老相關、脅迫響應與抗逆、次生代謝、其它代謝、未知或預測蛋白等類別，這些基因可能使3000yr側柏通過調節(jié)體內生理生化變化來抵御各種逆境。
　?。?）通過對 ROS清除相關基因 NAC、NQO、POD、

7、DXS、PAL、GAD、SSADH、GABA-T、TDB、TRF1在外源ABA、NaCl脅迫下基因表達分析表明，除SSADH在NaCl和TRF1在ABA脅迫下表現(xiàn)為基因表達水平先受到明顯抑制，隨后逐漸增強；其余基因則是隨著脅迫時間延長，基因表達水平先明顯升高，后逐漸降低或保持較高水平，并且與H2O2含量成正相關關系，表明這些基因可能在側柏脅迫響應過程中對ROS動態(tài)平衡起到調控作用，從而間接說明這些基因可能在側柏古樹ROS清除機制中具有重

8、要作用。
　　綜上所述，本研究在不同樹齡側柏ROS清除系統(tǒng)測定分析的基礎上，首次利用Solexa高通量測序技術對側柏葉片的轉錄組及不同樹齡的表達譜進行測序分析，發(fā)現(xiàn)在信號轉導、轉錄因子、ROS清除、抗逆、次生代謝等差異表達基因中，3000yr側柏中有許多相關基因的表達量高于20yr側柏，說明這些基因對3000yr側柏抗衰老機制具有重要作用；并通過集中分析ROS動態(tài)平衡相關基因在脅迫響應中表達模式變化，探討ROS調控對側柏抗衰老分子