側(cè)柏古樹抗衰老分子機(jī)理研究.pdf

1、古樹壽命長(zhǎng)達(dá)幾千年仍不見衰老，其生理與分子調(diào)控機(jī)制如何？成為近年來植物抗衰老研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一；而活性氧（ROS）的動(dòng)態(tài)平衡被認(rèn)為是影響植物衰老的主要因素之一。本文2010年以陜西黃帝陵樹齡為20yr和3000yr側(cè)柏（Platycladus orientalis）葉片為研究材料，在對(duì)ROS生成與清除機(jī)制研究的基礎(chǔ)上，通過Solexa高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜測(cè)序分析，發(fā)掘與樹齡相關(guān)的差異表達(dá)功能基因；并應(yīng)用實(shí)時(shí)定量qRT-PCR

2、技術(shù)，集中研究ROS動(dòng)態(tài)平衡相關(guān)基因在側(cè)柏幼苗受到NaCl、ABA脅迫時(shí)基因表達(dá)模式的變化情況，從而探討ROS清除機(jī)制在側(cè)柏抗衰老機(jī)制中的貢獻(xiàn)。主要結(jié)論如下：
　?。?）通過對(duì)20yr和3000yr側(cè)柏H2O2和相關(guān)清除系統(tǒng)研究表明，3000yr側(cè)柏葉片H2O2含量在生長(zhǎng)季中高于20yr，而季末低于20yr；但3000yr側(cè)柏谷胱氨酸還原酶（GR）活性及谷胱甘肽（GSH）含量在季中明顯高于20yr側(cè)柏，而超氧化物歧化酶（SOD）活

3、性及抗壞血酸（AsA）含量基本沒有變化；同樣，3000yr側(cè)柏在季末的ROS清除能力高于20yr。另外，研究還發(fā)現(xiàn)3000yr側(cè)柏種子萌發(fā)過程中仍具有較高的ROS清除能力。結(jié)果說明，3000yr側(cè)柏可通過較高水平的H2O2清除能力使細(xì)胞免受或減輕傷害，這可能是其抗衰老的主要生理機(jī)制之一。
　?。?）采用Solexa測(cè)序技術(shù)對(duì)20yr和3000yr側(cè)柏葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，總共進(jìn)行了13,600,516次讀數(shù)，經(jīng)組裝得到363,885

4、個(gè)Contig，68,219個(gè)獨(dú)立的Scaffold；進(jìn)一步拼接后共獲得51,664個(gè)Unigene，平均長(zhǎng)度為475 bp。另外，通過對(duì)側(cè)柏葉片轉(zhuǎn)錄組中進(jìn)行SSR位點(diǎn)的發(fā)掘，發(fā)現(xiàn)了含SSRs的序列703條，共742個(gè)SSRs，SSRs出現(xiàn)的頻率為1.36％。這些Unigene對(duì)側(cè)柏進(jìn)行抗衰老研究提供了重要基因資源。
　?。?）選擇10個(gè)側(cè)柏候選內(nèi)參基因，通過qRT-PCR分析其在不同樹齡、不同組織、不同脅迫（ABA、NaCl、P

5、EG、冷、熱脅迫）時(shí)基因表達(dá)變化，利用Ct值通過geNorm、NormFiner和BestKeeper軟件分析這些內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果表明：UBC和aTUB在不同樹齡、不同組織、不同處理表達(dá)穩(wěn)定。
　?。?）在轉(zhuǎn)錄組序列的基礎(chǔ)上，利用Solex技術(shù)對(duì)20yr與3000yr側(cè)柏葉片建立差異表達(dá)譜。通過嚴(yán)格篩選，發(fā)現(xiàn)在3000yr VS20yr側(cè)柏中滿足FDR≤0.001，而|log2Ratio|≥1的差異表達(dá)基因共有1202個(gè)

6、，其中上調(diào)基因578個(gè)，下調(diào)基因624個(gè)。并利用qRT-PCR對(duì)12個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行表達(dá)模式驗(yàn)證，結(jié)果與表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果基本一致。然后，根據(jù)功能對(duì)不同樹齡差異基因進(jìn)行分類，依次分為：信號(hào)傳導(dǎo)、激素、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白質(zhì)降解、ROS清除、衰老相關(guān)、脅迫響應(yīng)與抗逆、次生代謝、其它代謝、未知或預(yù)測(cè)蛋白等類別，這些基因可能使3000yr側(cè)柏通過調(diào)節(jié)體內(nèi)生理生化變化來抵御各種逆境。
　?。?）通過對(duì) ROS清除相關(guān)基因 NAC、NQO、POD、

7、DXS、PAL、GAD、SSADH、GABA-T、TDB、TRF1在外源ABA、NaCl脅迫下基因表達(dá)分析表明，除SSADH在NaCl和TRF1在ABA脅迫下表現(xiàn)為基因表達(dá)水平先受到明顯抑制，隨后逐漸增強(qiáng)；其余基因則是隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，基因表達(dá)水平先明顯升高，后逐漸降低或保持較高水平，并且與H2O2含量成正相關(guān)關(guān)系，表明這些基因可能在側(cè)柏脅迫響應(yīng)過程中對(duì)ROS動(dòng)態(tài)平衡起到調(diào)控作用，從而間接說明這些基因可能在側(cè)柏古樹ROS清除機(jī)制中具有重

8、要作用。
　　綜上所述，本研究在不同樹齡側(cè)柏ROS清除系統(tǒng)測(cè)定分析的基礎(chǔ)上，首次利用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)側(cè)柏葉片的轉(zhuǎn)錄組及不同樹齡的表達(dá)譜進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子、ROS清除、抗逆、次生代謝等差異表達(dá)基因中，3000yr側(cè)柏中有許多相關(guān)基因的表達(dá)量高于20yr側(cè)柏，說明這些基因?qū)?000yr側(cè)柏抗衰老機(jī)制具有重要作用；并通過集中分析ROS動(dòng)態(tài)平衡相關(guān)基因在脅迫響應(yīng)中表達(dá)模式變化，探討ROS調(diào)控對(duì)側(cè)柏抗衰老分子