熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)在SARS冠狀病毒S蛋白介導(dǎo)的免疫損傷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究中的應(yīng)用.pdf

1、目的： 活細(xì)胞在刺激因子作用下細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子間的相互作用以及由此而產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是一個動態(tài)的過程，傳統(tǒng)的免疫共沉淀等研究方法不可能進(jìn)行可視性的、實時動態(tài)觀察，因而可能丟失某些重要信息。因此，發(fā)展與建立一種能夠在活細(xì)胞水平實時動態(tài)觀察蛋白一蛋白之間相互作用的技術(shù)方法，對于研究生命過程細(xì)胞重要的病理生理反應(yīng)及依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制具有重要的科學(xué)應(yīng)用價值。熒光共振能量轉(zhuǎn)移 術(shù)的優(yōu)勢在于能夠定位、實時動態(tài)檢測活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用或蛋白

2、質(zhì)構(gòu)像的變化，已經(jīng)在生命科學(xué)領(lǐng)域研究生物大分子相互作用過程中顯示出了其極大的應(yīng)用拓展?jié)摿Α１菊n題通過建立以寬場熒光顯微鏡為基礎(chǔ)的FRET測定技術(shù)平臺，研究嚴(yán)重急性呼吸綜合癥冠狀病毒刺突蛋白(Spike，S)蛋白介導(dǎo)免疫損傷的可能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 內(nèi)容和方法： 一、寬場熒光顯微鏡下FRET穩(wěn)態(tài)熒光強(qiáng)度測定的技術(shù)平臺構(gòu)建 1、構(gòu)建青色熒光蛋白(Cyan Fluorescent Protein，CFP)和黃色熒光蛋白(Y

3、ellow FllJorescent Protein，YFP)的融合蛋白質(zhì)粒，pCFP-YFP，設(shè)置為FRET檢測陽性對照質(zhì)粒；研究寬場熒光顯微鏡檢測FRET的圖像對齊及主要影響因素，推導(dǎo)FRET檢測中圖像對齊的數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化FRET結(jié)果。 2、分別用CFP和YFP標(biāo)記雌激素受體alpha(Estrogen Receptor-α，ER α)構(gòu)建pCFP-ER和pYFP-ER質(zhì)粒，以探討不同比例供受體對FRKT檢測結(jié)果的影響。

4、 3、構(gòu)建pECFP-YFP和pEYFP-CFP熒光報告質(zhì)粒，作為快速構(gòu)建FRET檢測的供受體熒光融合蛋白對的工具載體。 二、應(yīng)用FRET技術(shù)研究SARS冠狀病毒S蛋白介導(dǎo)的干擾素Gamma (InterferonGamma，IFN γ)可誘導(dǎo)的信號通路關(guān)鍵信號分子，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(Signal TransdtJcer and Activation of TralqSCription 1， STAT1)的激活。

5、 1、構(gòu)建作為FRET供受體對的分別表達(dá)STAT1和STAT1突變體(STAT1701，即701位點突變使SH2功能域失活)熒光融合蛋白的質(zhì)粒pSTAT1-CFP和pSTAT1-YFP等；應(yīng)用FRET技術(shù)檢測基礎(chǔ)狀態(tài)下活細(xì)胞內(nèi)STAT1-STAT1的相互作用及IFN?或SARS冠狀病毒S蛋白刺激下STAT1激活構(gòu)像的改變。 2、應(yīng)用電泳遷移率變動分析(Electrophoretic Mobility Shift Assay，

6、EMSA)和RT-PCR方法進(jìn)一步確證SARS冠狀病毒S蛋白對IFNγ可誘導(dǎo)的信號通路關(guān)鍵信號分子STAT1的激活，以及對STAT1同源二聚體轉(zhuǎn)錄激活子的重要靶基因干擾素調(diào)節(jié)因子1(IFN regulated factor-1，IRF-1)的轉(zhuǎn)錄激活影響。 結(jié)果： 一、成功建立寬場熒光顯微鏡下穩(wěn)態(tài)熒光強(qiáng)度測定檢測FRET的技術(shù)平臺： 1、通過比較圖像對齊方法在FRET檢測中的應(yīng)用，以及旋轉(zhuǎn)偏移對FRET結(jié)果的可能

7、影響，推導(dǎo)了新的圖像對齊數(shù)學(xué)模型，使之不僅能夠校準(zhǔn)水平偏移亦能夠校準(zhǔn)旋轉(zhuǎn)偏移，經(jīng)圖像對齊后像素一像素解析的FRET結(jié)果明顯改善。 2、探討了寬場熒光顯微鏡下FRET檢測的熒光滲漏及背景熒光的去除問題，建立了FRET效率檢測的程序與方法，成功進(jìn)行了圖像標(biāo)準(zhǔn)化處理，經(jīng)陽性模型驗證表明：表達(dá)CFP-YFP融合蛋白陽性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后經(jīng)FRET測定計算后表現(xiàn)為強(qiáng)陽性，已知供受體熒光融合蛋白存在FRET關(guān)系的分別表達(dá)CFP-ER和YFP

8、-ER 的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后FRET檢測為陽性，而僅表達(dá)熒光蛋白CFP或YFP的空載質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后FRET檢測計算為陰性。 3、各種標(biāo)準(zhǔn)化FRET效率的方法都有一定的局限性，當(dāng)供受體比例相似時，如分子內(nèi)FRET，E描述效果最好，當(dāng)比例相差較大時，N<,FRET>效果較好，F(xiàn)RETN不能很好的描述FRET效率。 4、成功構(gòu)建pECFP-YFP和pEYFP-CFPFRET載體。 二、應(yīng)用建立的寬場熒光顯微鏡FRET效

9、率測定方法發(fā)現(xiàn)SARS冠狀病毒S蛋白能夠模擬INFγ激活STAT1信號分子，誘導(dǎo)干擾素可誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄激活。 1、熒光顯微鏡下可以觀察到轉(zhuǎn)染pSTAT1-CFP或pSTAT1-YFP細(xì)胞的熒光主要分布于細(xì)胞漿，細(xì)胞核僅有少量表達(dá)。S蛋白或INFγ刺激后熒光轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核。分別單轉(zhuǎn)pCFP-STAT1，pYFP-STAT1，pYFP-STAT1-CFP，pCFP-STAT1-YFP，pSTAT1701-CFP細(xì)胞的熒光分布基態(tài)下主要

10、定位于細(xì)胞漿， INFγ刺激后熒光分布無明顯變化。 2、共轉(zhuǎn)染pSTAT1-CFP和pSTAT1-YFP質(zhì)粒的1611BE基態(tài)下細(xì)胞核與細(xì)胞漿的FRET效率檢測陽性，核漿FRET效率分布無明顯差異，INFγ或S蛋白刺激后核內(nèi)FRET效率降低而胞漿不變。共轉(zhuǎn)染pSTAT1701-CFP和pSTAT1701-YFP質(zhì)粒的16HBE細(xì)胞基態(tài)下FRET效率檢測亦為陽性。相比之下，共轉(zhuǎn)染pCFP-STAT1和pYFP-STAT1質(zhì)粒的16

11、HBE細(xì)胞FRET效率檢測為陰性。 3、EMSA與RT-PCR實驗結(jié)果證實：經(jīng)INFγ刺激的的人支氣管上皮細(xì)胞(HumanBronchial Epithelial Cell，16HBE)細(xì)胞核蛋白顯著增強(qiáng)了與IRF-1基因啟動子上的干擾素gamma激活序列(IFN Gamma Activated Sequence，GAS) DNA基序的結(jié)合，誘導(dǎo)了IRF-1基因的轉(zhuǎn)錄；共轉(zhuǎn)染pSTAT1-CFP和pSTAT1-YFP質(zhì)粒的16H

12、BE細(xì)胞核蛋白進(jìn)一步增強(qiáng)了與GAS的結(jié)合，并相應(yīng)地增加了IRF-1基因的轉(zhuǎn)錄；共轉(zhuǎn)染表達(dá)STAT1突變體的pSTAT1701-CFP和pSTAT1701-YFP質(zhì)粒細(xì)胞下調(diào)了IRF-1基因的轉(zhuǎn)錄激活。 結(jié)論： 1、成功建立寬場熒光顯微鏡下穩(wěn)態(tài)熒光強(qiáng)度測定檢測FRET效率的技術(shù)平臺，通過數(shù)學(xué)模型改良明顯改善像素-像素解析的FRET結(jié)果，提高了FRET測定的準(zhǔn)確性。 2、STAT1C末端連接CFP或YFP的熒光融合蛋