基于熒光共振能量轉移技術的小泛蛋白樣修飾物的研究.pdf

1、小泛素相關修飾物（small ubiquitin-related modifier，SUMO）是一類新發(fā)現的類泛素修飾物，廣泛存在于真核生物中，是由多個成員組成的蛋白質家族。在哺乳動物中已經發(fā)現3種SUMO分子，分別為SUMO-1、SUMO-2及SUMO-3。SUMO修飾是一個動態(tài)的可逆過程，在一系列酶的催化下，SUMO與靶蛋白Lys側鏈ε-NH2通過異肽鍵共價相連，從而介導不同的細胞內反應。SUMO特異性蛋白酶（sentrin-spe

2、cific proteases，SENPs）在SUMO修飾過程中起了重要的調節(jié)作用。SENP是半胱氨酸蛋白酶超家族的成員之一，在真核生物體內主要功能是切除SUMO前體的C端，及介導去SUMO化使SUMO分子重新進入循環(huán)。至今已鑒定了7種哺乳動物的SUMO特異性蛋白酶（sentrin-specific proteases，SENPs）家族成員，稱為SENP-1，-2，-3，-5，-6，-7，和-8，SENP每一個成員有不同的細胞定位和底物

3、特異性。
　　 熒光共振能量轉移（fluorescence resonace energy transfer，FRET）技術因其對距離的極度敏感性，被廣泛用于生物大分子結構、性質、反應機理以及定量分析等方面的研究。FRET以它穩(wěn)定、無生物體毒性、不需任何外源反應底物及表達無種屬和組織特異性的優(yōu)點，成為檢測蛋白——受體、蛋白——蛋白之間相互作用和相對空間位置的“分子尺”。
　　 本研究的最終目的是檢測不同SENP對于3種S

4、UMO底物的底物特異性，測定酶活；構建可在體外應用熒光共振能量轉移（FRET）技術檢測SENP酶活性的ECFP-SUMO-EYFP生物檢測系統。從而建立一種能用于臨床的的SENP蛋白酶活性檢測的體外FRET系統。
　　 在大腸桿菌中誘導表達在供體增強型青色熒光蛋白（enhanced Cyan Fluorescent Poretin，ECFP）和受體增強型黃色熒光蛋白（enhanced Yellow Fluorescent Por

5、etin，EYFP）之間以帶有SENP特異性識別酶切位點的SUMO肽段連接的融合蛋白ECFP-SUMO1，2，3-EYFP；原核表達哺乳動物的SENP-1，-2，-3，-5 C端催化域及SENP-8全蛋白。融合蛋白ECFP-SUMO1，2，3-EYFP及SENP-1，-2，-3，-8可溶性表達在上清中。將以上蛋白進行Ni柱親和層析。最終，融合蛋白ECFP-SUMO1，2，3-EYFP及SENP1C，2C，8可溶性表達在上清中并得到純化，