應(yīng)用熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）法研究瘦素及外力刺激對于軟骨細(xì)胞骨架調(diào)控蛋白RhoA的作用.pdf

1、研究背景與目的：骨關(guān)節(jié)炎(OA)是骨科的常見疾病之一，是一種退行性關(guān)節(jié)疾病，其病因尚不明了。其中，長期超負(fù)荷的外力作用是較為公認(rèn)的OA危險因素之一，因而在體重超重人群中，OA的發(fā)病率顯著增加。瘦素(leptin)是一種白色脂肪組織分泌的小分子量蛋白，在體重超重人群中其血清含量往往升高。2003年Dumond等人發(fā)現(xiàn)OA患者關(guān)節(jié)液中瘦素(leptin)含量明顯高于正常人，提示瘦素可能在OA的發(fā)病過程中起到某種作用。RhoA蛋白是調(diào)控細(xì)胞骨

2、架的重要分子之一，OA軟骨細(xì)胞與正常軟骨細(xì)胞的顯著差異之一就是細(xì)胞骨架含量的明顯升高。本文擬通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)法，研究活細(xì)胞條件下瘦素及外力刺激對于正常軟骨細(xì)胞RhoA蛋白的作用，分別探討瘦素、外力對于軟骨細(xì)胞細(xì)胞骨架的影響，為OA的病因研究提供參考。 研究方法：以編碼YFP-RhoA-PKN-CFP融合蛋白的pRaichu-1237x質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染正常人軟骨細(xì)胞。觀察在200ng/ml瘦素刺激下，RhoA蛋白的FRE

3、T信號改變。另外，應(yīng)用原子力顯微鏡(AFM)作為施力工具，觀察在AFM的輕敲模式與接觸模式作用下，RhoA蛋白的FRET信號改變。 研究結(jié)果：在200ng/ml的瘦素作用下，軟骨細(xì)胞偽足迅速回縮，F(xiàn)RET信號逐漸減弱消失，直至最終細(xì)胞皺縮，形成許多細(xì)胞膜周圍的小泡。 軟骨細(xì)胞在接受AFM輕敲模式刺激后逐漸出現(xiàn)胞質(zhì)回縮，F(xiàn)RET信號明顯增強(qiáng)，以接觸探針刺激處最為明顯。 軟骨細(xì)胞在接受AFM接觸模式刺激后，細(xì)胞形態(tài)無

4、明顯改變，F(xiàn)RET信號明顯增強(qiáng)，以接觸探針刺激處最為明顯。 研究結(jié)論： (1)以大劑量瘦素(200ng/ml)刺激軟骨細(xì)胞，不但不能激活RhoA蛋白，反而會使RhoA蛋白的FRET信號明顯減弱，并導(dǎo)致軟骨細(xì)胞逐漸皺縮，最終在細(xì)胞膜表面出現(xiàn)類似凋亡小體的小泡，提示大劑量的瘦素可能誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的凋亡。 (2)AFM作為施力工具可以直接給予體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞以力學(xué)刺激。以AFM的輕敲模式和接觸模式作用于軟骨細(xì)胞可以分別