可溶性mB7-H4對Con A誘導小鼠肝損傷的保護作用.pdf

1、[目的] 在機體的免疫應答過程中，B7-H4作為重要的共刺激分子，為T、B細胞的激活提供了重要的共刺激信號。活化的T細胞產(chǎn)生以IL-10、IL-2、IL-12、FNF-α、γ-干擾素(IFN-γ)為主的細胞因子介導對肝細胞的免疫性損傷成為病毒性肝炎的主要致病機理。研究人員發(fā)現(xiàn)B7-H4分子在自身免疫性疾病中對T細胞的活化發(fā)揮著一定的負性調(diào)控作用，它能抑制CD4+T細胞的活化、增殖，阻止細胞周期在G0/G1期。但是，B7-H4分子

2、對T細胞免疫應答進行的精細調(diào)節(jié)機制還有待進一步闡明。 本文采用Con A誘導性肝損傷小鼠模型進行可溶性mB7-H4蛋白干預實驗，以探討可溶性mB7-H4蛋白是否對肝臟的免疫性損傷具有保護作用及其作用機制。 本研究將流體動力法(Hydrodynamies-based procedure)應用于小鼠可溶性mB7-H4蛋白的體內(nèi)表達，成功地將pcDNA3.1/mB7-H4-Fc表達載體導入了小鼠肝臟，獲得了重組pcDNA3.1

3、/mB7-H4-Fc在肝內(nèi)的高效穩(wěn)定表達。通過可溶性mB7-H4蛋白對Con A致肝臟免疫性損傷的干預實驗初步表明，可溶性mB7-H4蛋白對Con A導致的T細胞介導的肝臟免疫性損傷具有保護作用。這一發(fā)現(xiàn)為可溶性mB7-H4蛋白在病毒性肝炎臨床防治方面的研究提供了重要的理論依據(jù)。 [方法] 1.可溶性mB7-H4蛋白的表達與純化 (1)將構(gòu)建好的原核表達質(zhì)粒pET/mB7-H4，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5 α進行

4、保種，轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)，進行可溶性蛋白mB7-H4的表達。 (2)經(jīng)IPTG誘導，進行時間和溫度的定位，確定最佳表達時間，最佳表達溫度和最佳IPTG濃度。 (3)采用Ni-NTA親和層析方法，在變性條件下，給予大量表達mB7-H4蛋白以純化。然后，通過尿素梯度復性方法，獲得大量可溶性mB7-H4蛋白。 (4)復性后的可溶性mB7-H4蛋白，經(jīng)去除內(nèi)毒素處理，用于Con A誘導小鼠肝損傷的治療

5、。 2.pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠體內(nèi)表達 (1)采用即時RT-PCR的方法，定量檢測pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠體內(nèi)的表達。 (2)建立可溶性融合蛋白mB7-H4-hIg的ELISA檢測方法，定量檢測pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠體的內(nèi)表達。 3.可溶性mB7-H4蛋白對Con A誘導小鼠肝損傷的保護作用 (1)檢測血清ALT和AST，觀察分析可溶性mB

6、7-H4蛋白對Con A誘導小鼠肝損傷的保護作用。 (2)肝組織病理切片，判斷可溶性mB7-H4蛋白對Con A誘導小鼠肝損傷的保護作用。 (3)檢測血清IL-4和IFN-γ，觀察分析可溶性mB7-H4蛋白對Con A誘導小鼠肝損傷的保護作用。 [結(jié)果] 1.可溶性蛋白mB7-H4的表達與純化pET/mB7-H4導入E.coli BL21(DE3)后，經(jīng)IPTG誘導產(chǎn)生包涵體mB7-H4蛋白。包涵體經(jīng)過洗

7、滌、復性、透析、親和層析和去除內(nèi)毒素后，獲得可溶性mB7-H4蛋白，純度在90％以上。 2.pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠體內(nèi)表達 (1)即時定量RT-PCR結(jié)果表明，pmB7-H4-Fc經(jīng)小鼠尾靜脈注射，能夠穩(wěn)定地表達，量在48小時達到最高。 (2)采用ELIsA技術(shù)，定量檢測小鼠可溶性融合蛋白mB7-H4-hIg,結(jié)果表明，經(jīng)尾靜脈注射的pcDNA3.1/mB7-H4-Fc，能在肝組織中穩(wěn)定表達，

8、48小時分泌的量達到最高值，即120ng/ml。 3.可溶性mB7-H4蛋白對Con A誘導小鼠肝損傷的保護作用 (1)小鼠血清ALI和AST 在注射Con A后，各組小鼠血清ALT和AST水平較正常水平均有明顯升高，達注射前的3～5倍。表達載體組和蛋白組ALT和AST值均明顯低于陽性對照組和/或空載體組。表達載體組與陽性對照組間血清ALT和AST濃度，經(jīng)方差分析：①Falt=9668，p=0.004；Fast=12.3

9、68，p=0.002(質(zhì)粒組)；②Falt=12.394，p=0.001；Fast=6.422，p=0.016(蛋白組)。表達載體組與陽性對照組間血清ALT和AST濃度比較，具有顯著性差異。結(jié)果表明，可溶性mB7-H4蛋白在Con A誘導小鼠肝損傷中能減輕Con A帶來的損傷，具有保護作用。 (2)肝組織病理切片在注射Con A后，Con A組和空載體組肝細胞即出現(xiàn)變性改變，肝細胞腫脹、胞漿疏松、細胞結(jié)構(gòu)不完整、肝竇內(nèi)紅細胞淤積

10、，門靜脈區(qū)和中央靜脈區(qū)可見大量淋巴細胞、多葉核粒細胞浸潤，胞核破損，胞漿出現(xiàn)囊性或空泡樣改變。相比之下，表達載體組以及蛋白組的小鼠在注射Con A后，其肝臟的損傷比較輕，匯管區(qū)可見少量淋巴細胞浸潤，有些細胞胞漿出現(xiàn)了空泡樣改變，但胞核完整，肝臟內(nèi)未見壞死區(qū)。結(jié)果表明，可溶性mB7-H4蛋白在Con A誘導小鼠肝損傷中，能減輕Con A帶來的損傷，具有保護作用。 (3)小鼠血清IL-4和IFN-γ在注射Con A后，各組小鼠血清I

11、L-4和IFN-γ水平較正常水平均有明顯升高，達正常值的5～10倍。表達載體組和蛋白組IL-4和IFN-γ值明顯低于陽性對照組和/或空載體組。表達載體組與陽性對照組間血清IFN-γ濃度，經(jīng)方差分析：①Falt=13.728，p=0.001；Fast=22.250，p<0.0001(質(zhì)粒組)；②Falt=20.6456，p<0.0001；Fast=10.573，p=0.002(蛋白組)。表達載體組與陽性對照組間血清IL-4和IFN-γ濃度