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1、第一部分,目的:探討RGD光化學(xué)偶聯(lián)法修飾去細(xì)胞光氧化牛頸靜脈基質(zhì)的方法,以及修飾的RGD肽在體內(nèi)存留情況。 方法: 1.制備去細(xì)胞、光氧化交聯(lián)的牛頸靜脈基質(zhì)材料,裁減成1×1cm<'2>大小的48個(gè)血管片,隨機(jī)分入12個(gè)組中;將RGD-FITC和光偶合劑SANPAH分別配制成0.12mM、0.6mM、1.2mM和6mM四種濃度的溶液,按照1∶0、1∶1和1∶10的三個(gè)反應(yīng)摩爾比在避光下反應(yīng)2小時(shí),制成12組反應(yīng)液。每組
2、100μl反應(yīng)液滴加在血管片上,365nm的紫外線照射5分鐘,引發(fā)光化學(xué)偶聯(lián),將RGD共價(jià)結(jié)合到牛頸靜脈血管片上,震蕩漂洗6小時(shí),樣品制成快速冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察。通過觀察基質(zhì)材料表面不同濃度、不同摩爾比反應(yīng)接枝后的熒光差別,從而初步推斷出合適的反應(yīng)和結(jié)合濃度。 2.以濃度為0.6mM、反應(yīng)摩爾比為1∶1的FITC-RGD和SANPAH,同法制備表面修飾后的牛頸靜脈血管片(實(shí)驗(yàn)組),物理吸附RGD的血管片作為對(duì)照組,8只S
3、D大鼠隨機(jī)平均分入上述兩組中,將血管片分別植入兩組大鼠下腔靜脈,于術(shù)后5天、10天、15天、20天取出標(biāo)本,進(jìn)行快速冰凍切片,觀察并照相留底,以了解熒光標(biāo)記的RGD是否能經(jīng)受體內(nèi)血流的沖擊和細(xì)胞的吞噬而仍然存在。 結(jié)果:應(yīng)用光偶聯(lián)劑后,血管內(nèi)膜面有一層較強(qiáng)的熒光,隨著RGD和SANPAH的濃度的升高,熒光整體上是越來越強(qiáng),但是二者的濃度高于0.6mM時(shí),熒光差別不明顯;相同濃度下當(dāng)二者的反應(yīng)摩爾比為1∶1時(shí),熒光最強(qiáng)。經(jīng)過光化學(xué)
4、偶聯(lián)后的FITC-RGD肽在體內(nèi)20天仍然存在,只是熒光略有衰減,單純涂覆的RGD組綠色熒光5天即完全消失。 結(jié)論:光偶聯(lián)劑SANPAH能夠?qū)崿F(xiàn)RGD與去細(xì)胞光氧化牛頸靜脈的化學(xué)偶聯(lián), RGD和SANPAH較為合適的接枝反應(yīng)濃度是0.6mM,反應(yīng)摩爾比是1∶1,光化學(xué)交聯(lián)方法接枝的RGD在體內(nèi)保留時(shí)間至少超過20天,體內(nèi)存留效果良好。 第二部分,目的:探討RGD表面修飾后的牛頸靜脈體內(nèi)和體外促進(jìn)再內(nèi)皮化的情況。
5、方法: 1.體外細(xì)胞黏附生長(zhǎng):牛頸靜脈經(jīng)過去細(xì)胞和光氧化交聯(lián)后,裁成與24孔培養(yǎng)板孔徑相同大小的、直徑1.6cm的血管片,用光偶聯(lián)劑SANPAH采用第一章的方法將RGD接枝到牛頸靜脈血管片上,以未接枝RGD的作為空白對(duì)照。在其上面種植人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株細(xì)胞(CRL-2480)5×10<'5>/ml,靜態(tài)培養(yǎng)5天,取1,3,5天標(biāo)本消化血管片表面細(xì)胞并記數(shù),標(biāo)本切片HE染色,對(duì)比RGD接枝后和空白對(duì)照組血管片表面細(xì)胞黏附數(shù)目和HE
6、的染色結(jié)果,以探討接枝RGD體外能否促進(jìn)細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)。 2.再內(nèi)皮化的體內(nèi)實(shí)驗(yàn):8只SD大鼠平均分入處理組和對(duì)照組,將RGD表面修飾和未修飾的血管片植入下腔靜脈,采用連續(xù)縫合的方式進(jìn)行補(bǔ)片,術(shù)后兩組均給予10mg/kg/天劑量的阿托伐他汀喂養(yǎng),分別于術(shù)后5天、10天、15天、20天取出血管片,標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋、HE染色、掃描電鏡和Ⅷ因子免疫組織化學(xué)檢測(cè),取普通顯微鏡40倍下的HE染色的血管片留底照片,在Image Pro Pl
7、us圖像測(cè)量軟件上測(cè)量?jī)?nèi)膜厚度,計(jì)算平均值,兩組間進(jìn)行比較。 結(jié)果: 1.體外培養(yǎng): (1)細(xì)胞記數(shù):細(xì)胞培養(yǎng)第1、3、5天,RGD組細(xì)胞數(shù)目均多于對(duì)照組。 (2)標(biāo)本石蠟包埋后切片HE染色結(jié)果:第1天各組血管片表面細(xì)胞排列密集,紊亂,未完全鋪開;第3天,對(duì)照組血管表面細(xì)胞數(shù)量減少明顯,有斷裂出現(xiàn);RGD組細(xì)胞連接成片,呈單層排布;第5天這種現(xiàn)象更明顯。 2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn): (1)組織大體觀結(jié)
8、果:血管片隆起于下腔靜脈表面,質(zhì)軟,周圍粘連較輕,顏色變白,亞甲蘭的藍(lán)色已完全消失。剖開下腔靜脈后見補(bǔ)片表面光滑,無血栓,縫線清晰可見,其上附著一薄層增厚組織,薄而透明,為新生內(nèi)膜組織。 (2)HE染色結(jié)果:經(jīng)過光氧化交聯(lián)的BJV植入體內(nèi),細(xì)胞浸潤(rùn)受到抑制,浸潤(rùn)全層首先在血管片吻合區(qū)域發(fā)生, 20天兩組中間區(qū)域均未能浸潤(rùn)全層,只是在小部分個(gè)別區(qū)域全層BJV有細(xì)胞相連;RGD組在新生內(nèi)膜中有更多的細(xì)胞,而對(duì)照組則主要還是纖維素等不
9、定型成分。新生內(nèi)膜在吻合區(qū)域薄,中間較厚,剔除新生內(nèi)膜后的HE切片顯示:術(shù)后5天,RGD組BJV表面有細(xì)胞黏附,對(duì)照組幾乎沒有細(xì)胞;RGD組5天即能在內(nèi)膜面看到內(nèi)皮樣細(xì)胞覆蓋,10天完整覆蓋補(bǔ)片,對(duì)照組則需要20天才能看到內(nèi)膜面較多的細(xì)胞覆蓋。 (3)Ⅷ因子染色結(jié)果:RGD表面修飾后的血管片植入大鼠體內(nèi)5天Ⅷ因子染色即呈陽性,而且新生內(nèi)膜中已經(jīng)形成新生微血管,10天陽性更強(qiáng);對(duì)照組5~15天內(nèi)膜面只有很少的細(xì)胞,Ⅷ因子染色是陰性
10、,20天雖然內(nèi)膜面雖有較多的細(xì)胞,但是Ⅷ因子染色仍是陰性。 (4)掃描電鏡結(jié)果:RGD組術(shù)后5天內(nèi)膜面可見較多的上皮樣細(xì)胞順血流方向排列,但是細(xì)胞之間有間距,術(shù)后10天內(nèi)膜面附著一層排列致密、整齊的內(nèi)皮細(xì)胞,細(xì)胞間可見形成的牢固連接;對(duì)照組術(shù)后10天內(nèi)膜面仍是增厚的纖維素樣物質(zhì),下面似有細(xì)胞突起,可能為平滑肌或成纖維細(xì)胞,表面無內(nèi)皮樣細(xì)胞覆蓋,只是黏附一些大分子物質(zhì)和散在的一些小細(xì)胞。 (5)內(nèi)膜厚度的比較:術(shù)后第5天,
11、RGD組新生內(nèi)膜較對(duì)照組厚,但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,隨后的10天、15天、20天RGD組新生內(nèi)膜均較對(duì)照組薄,而且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組新生內(nèi)膜總體上說隨著時(shí)間的延長(zhǎng),厚度越來越大,術(shù)后15天時(shí)達(dá)到高峰,20天即開始下降,RGD組術(shù)后10天新生內(nèi)膜厚度有波折,其在20天時(shí)下降到術(shù)后5天的水平,而對(duì)照組厚度值仍然較大。 結(jié)論:RGD表面修飾的牛頸靜脈,體外能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附與生長(zhǎng),體內(nèi)能快速達(dá)到內(nèi)皮化的效果,雖然仍然伴有內(nèi)膜的增生,但是
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