同種大白兔頸動脈移植后血管一氧化氮合酶活性變化的意義.pdf

1、中國醫(yī)科大學博士學位論文同種大白兔頸動脈移植后血管一氧化氮合酶活性變化的意義姓名：朱兵申請學位級別：博士專業(yè)：兒科學指導教師：李心元20020301統(tǒng)分析儀、S一500P型紫外線可見光連續(xù)分光光度儀(法國SECOMAM公司)、總RNA提取及eDNA合成試劑盒(日本TaKaRa生物技術有限公司)、ecNOS／iNOS引物(北京奧科生物工程公司)、NO試劑盒(南京建成生物工程研究所)、ecNOS／iNOS免疫組織化學試劑金(內(nèi)含羊抗兔ecN

2、OS／iNOS多克隆抗體血清和sP通用型試劑盒，北京中山生物工程公司)、RPMI1640營養(yǎng)液(美國GibeoBRL公司)、DMSO(德國Merck公司)、青霉素鈉(PC，400萬單位)、硫酸鏈霉索(SM，100萬單位)。3動物模型：按人類無菌手術標準進行各種試劑配制及自體／異體頸動脈移植手術。其中，A組采用自體血管原位植入。B組采用新采集的異體血管，肝素鹽水(HNS，25IO／m1)沖洗后立即植入受者頸動脈。C組采用PC／SM(50I

3、u／fnl)處理后室溫密閉保存(72小時內(nèi)使用)的異體血管植入。D組植入PC／SM(50IU／m])處理后液氮保存的血管。術后觀察I一4周。取材時記錄移植動脈周圍改變及動脈外觀、直徑、通暢、狹窄及程度。采集受者血漿和植入血管等標本分別保存于EDTA一2Na／抑肽酶塑料管和液氮中備檢。。4檢測指標：(1)血漿NO濃度(硝酸還原酶法)：按照NO試劑盒說明書操作。(2)移植血管病理學改變(HE染色法)：從形態(tài)上單盲法觀察記錄移植血管腔內(nèi)有無血

4、栓及血栓性質(zhì)、管壁各層結(jié)構是否清晰可辨、Lc浸潤情況、細胞漿有無強嗜酸性反應、核染色質(zhì)濃縮邊集、核固縮或核碎裂、強嗜堿性小體形成及內(nèi)膜下及中膜增生程度。(3)iNOS／eeNOS活性(免疫組化染色法)：按照iNOS／eeNOS免疫組化試劑盒說明書操作對盤管組織切片進行免疫組化染色。單盲法觀察記錄著色(深棕色)部位、顆粒大小及著色密度、染色細胞多寡并分級評分，o分：陰性(一)，1分：弱陽性()，2分：中度陽性()，3分：強陽性()。統(tǒng)計表

5、達率和表達強度。(4)iNOS／ecNOSmRNA表達(1it—PCR法)：用提取的血管組織總PdqA合成eDNA，用PrimerPremiere軟件分別以兔科iNOS／eeNOS基因序列設計引物序列并按設計條件進行擴增。其中ecNOS—U序列：57一孵CCGCTACCAGCCAGAC一3’；eeNOS—L序列：5’一CGAGGGACACCACATCATAC一37；iNOS—U序列：5’一CATTGCATTCAGATcCCGAAACG一