應(yīng)用LCM技術(shù)結(jié)合冰凍切片捕獲奶牛生精細(xì)胞及RNA的提取.pdf

1、精原細(xì)胞經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂后生成圓形精子細(xì)胞，再經(jīng)變態(tài)發(fā)育，最終成為成熟精子，在變態(tài)發(fā)育過(guò)程中，染色質(zhì)高度固縮，轉(zhuǎn)錄活性逐漸降低，并伴隨細(xì)胞質(zhì)的大量丟失，導(dǎo)致精子細(xì)胞內(nèi)RN A含量極少。目前，精子內(nèi)種類繁多的RN A成分雖已被檢測(cè)證實(shí)，但精子是否存在轉(zhuǎn)錄活性仍存在較大爭(zhēng)議，因此，研究精子變態(tài)前后轉(zhuǎn)錄表達(dá)趨勢(shì)具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)模式動(dòng)物小鼠精子發(fā)育過(guò)程的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行了研究，通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)在圓形、長(zhǎng)形精子細(xì)胞和成熟精子間存在大量差異表

2、達(dá)基因，且通過(guò)熒光定量 PCR驗(yàn)證了結(jié)果的可靠性。對(duì)于荷斯坦牛精子發(fā)育過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)是否和嚙齒動(dòng)物有相同的變化趨勢(shì)，其與體細(xì)胞的差異性仍需進(jìn)行深入研究。
　　本實(shí)驗(yàn)采集了荷斯坦牛睪丸及附睪組織，在前期小鼠實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)延長(zhǎng)組織塊平衡和切片染色時(shí)間及加大激光能量及頻率等條件優(yōu)化，建立了合適的荷斯坦牛睪丸組織冰凍切片制作、染色及激光顯微切割捕獲體系。通過(guò)優(yōu)化后的體系共捕獲了90576個(gè)圓形精子細(xì)胞、122651個(gè)長(zhǎng)形精子細(xì)胞及67

3、818個(gè)精原干細(xì)胞樣品（每樣品各三個(gè)生物學(xué)重復(fù)），并通過(guò)精子浮游法獲得107個(gè)附睪尾精子，為后續(xù)研究提供了可靠的實(shí)驗(yàn)材料。
　　由于精子難以裂解、RNA含量低，且制備難度大，本研究比較了兩種試劑盒及 Trizol法三種RNA制備方法的制備效果，發(fā)現(xiàn)RNeasy Kit的RNA制備效率高且效果穩(wěn)定（單個(gè)精子RNA含量為0.023~0.025 pg），可以用于后續(xù)高通量測(cè)序 RNA樣品的制備。并采用 PicoPureTMRNA Iso

4、lation Kit進(jìn)行了圓形、長(zhǎng)形精子細(xì)胞及精原干細(xì)胞的RNA制備。在進(jìn)行精子RNA制備時(shí)，采用的體細(xì)胞裂解液進(jìn)行了白細(xì)胞、上皮細(xì)胞等體細(xì)胞的去除，并利用白細(xì)胞和上皮細(xì)胞的特異表達(dá)基因CD45和CDH1及持家基因GAPDH（跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)引物）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)體細(xì)胞及基因組污染，以確保后續(xù)高通量測(cè)序的RN A樣品質(zhì)量。另外，本研究通過(guò)大量細(xì)胞樣本，測(cè)算了單個(gè)生精細(xì)胞RN A含量，單因子方差分析結(jié)果顯示，圓形精

5、子細(xì)胞、長(zhǎng)形精子細(xì)胞、附睪尾精子及精原干細(xì)胞 RN A含量有顯著差異，不但二倍體細(xì)胞（精原干細(xì)胞）和生殖細(xì)胞間存在顯著差異，隨著精子細(xì)胞的變態(tài)發(fā)育，其RN A含量逐漸減少，精子細(xì)胞圓形和長(zhǎng)形精子細(xì)胞中RN A含量分別為附睪尾精子的752和413倍。采用Smart-seq2方法對(duì)各級(jí)生精細(xì)胞cDNA進(jìn)行微量擴(kuò)增，并檢測(cè)其cDNA量及完整性，各樣品cDNA含量均高于20 ug，且在1~2 kb間均有目的產(chǎn)物，完整性較好，符合建庫(kù)要求。本研究