TCTE3、DNAH1與特發(fā)性弱精子癥關(guān)系的研究.pdf

1、背景與目的：
　　隨著男性學(xué)科相關(guān)領(lǐng)域研究的不斷開展，男性生育力的評(píng)價(jià)成為其發(fā)展的客觀需要，因此育齡男性不育也日漸成為全世界的問題，了解男性生育能力與不育癥的診斷和治療之間的關(guān)系，將為生殖醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展，提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也是新世紀(jì)男性學(xué)科相關(guān)領(lǐng)域中最有創(chuàng)造性的研究?，F(xiàn)代生存環(huán)境的的改變引起生殖健康受損，這也成為全球性的社會(huì)問題和醫(yī)學(xué)難題，其中男性生殖功能受損這一病因占50％。
　　男性精液質(zhì)量下降導(dǎo)致男性不育的原因很多，包

2、括精子生成障礙、精子活動(dòng)力低下等，最主要是因?yàn)榫踊顒?dòng)力低下而造成的弱精子癥（asthenozoospermia AZS）。精子活力是指精子前向運(yùn)動(dòng)的能力，是衡量精子質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)，也是精子進(jìn)入卵細(xì)胞胞漿，完成受精的重要條件。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）2010年第5版基于精子運(yùn)動(dòng)能力，將精子分為前向運(yùn)動(dòng)（Progressive motility PR）、非前向運(yùn)動(dòng)(Non-progre

3、ssive motility NP)、不活動(dòng)(Immotility IM)三個(gè)等級(jí);精子密度≥15×106/ml，前向運(yùn)動(dòng)(PR)≥32％，為正常精子活力;精子密度≥15×106/ml，前向運(yùn)動(dòng)(PR)＜32％為精子活力低下即弱精子癥。由于弱精子癥的病因很多并且復(fù)雜，對(duì)其發(fā)病機(jī)制的了解依然十分有限。
　　在多數(shù)病例中，精子活力和功能受損的潛在分子機(jī)制很大程度上仍鮮有研究。從精子細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)分析，精子的運(yùn)動(dòng)和功能在某種程度上都會(huì)受

4、到精子尾部鞭毛畸形的影響，其中包括線粒體排列、分布、缺失等的異常;外周致密纖維排列、數(shù)量、缺失等的異常;軸絲畸形等，特別是精子軸絲畸形對(duì)運(yùn)動(dòng)所造成的影響，常見的有:缺失兩個(gè)動(dòng)力蛋白臂，這種情況下，精子通常不能運(yùn)動(dòng)，并且這樣的患者往往會(huì)出現(xiàn)身體其它鞭毛系統(tǒng)，如呼吸系統(tǒng)的感染等;缺少內(nèi)側(cè)動(dòng)力蛋白支臂和放射橋等，此時(shí)全部精子均不能運(yùn)動(dòng)，軸絲柱狀形式消失，鞭毛粗細(xì)和長短都發(fā)生異常;缺少外側(cè)動(dòng)力蛋白臂，精子可以前向運(yùn)動(dòng)，但鞭毛擺動(dòng)頻率降低，前向移

5、動(dòng)速度受到影響，同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)外周微管的缺失和鞭毛的扭曲;缺少中央復(fù)合結(jié)構(gòu)和周圍連接結(jié)構(gòu)等。近年來對(duì)精子鞭毛軸絲微管蛋白臂的研究越來越多，周圍微管支臂的異常，可嚴(yán)重影響精子的運(yùn)動(dòng)和功能。因此，精子微管蛋白的分子結(jié)構(gòu)、修飾狀態(tài)、酶催化調(diào)節(jié)、相對(duì)表達(dá)量等的正常是確保精子正常運(yùn)動(dòng)必不可少的條件。
　　由于蛋白質(zhì)是一切生物生命過程的執(zhí)行者，所以全面研究蛋白質(zhì)在弱精子癥中的變化將為揭示弱精子癥發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。本研究通過檢測(cè)T復(fù)合體相關(guān)睪丸表

6、達(dá)3(T-complex associated testis expressed 3，TCTE3)和軸絲動(dòng)力蛋白1(Dynein Axonemal Heavy Chain 1，DNAH1)在正常男性精子和特發(fā)性弱精子癥患者精子中的表達(dá)，初步探究TCTE3和DNAH1在特發(fā)性弱精子癥發(fā)病過程的作用，通過精子相關(guān)基因、蛋白差異表達(dá)，為闡明不育癥的發(fā)病機(jī)制做出貢獻(xiàn)。
　　材料與方法：
　　1、研究對(duì)象
　　嚴(yán)格按照世界衛(wèi)生組

7、織第5版精液常規(guī)分析標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)供精志愿者和弱精子癥患者的知情同意，收集2012年7月至2012年11月河南省人類精子庫供精志愿者的合格精液標(biāo)本30例，作為正常對(duì)照組，年齡22-35(27.02±2.44)歲，精子密度≥20×106ml-1，精子前向運(yùn)動(dòng)(PR)≥32％;同期鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院男科確診為弱精子癥患者精液標(biāo)本30例，作為特發(fā)性弱精子癥組，年齡21-38(30.36±3.04)歲，精子密度≥20×106ml-1，精子前向運(yùn)動(dòng)(

8、PR)＜32％。兩組年齡比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，所有參與人員均進(jìn)行各項(xiàng)常規(guī)檢測(cè)，包括內(nèi)分泌激素、感染、免疫抗體、微生物等，檢查結(jié)果各參數(shù)均正常。
　　2、方法
　　2.1、Western印跡
　　采用Western-blot蛋白免疫印跡技術(shù)，檢測(cè)TCTE3蛋白和DNAH1蛋白在兩組精子中的表達(dá)。
　　2.2、RT-PCR
　　采用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)，檢測(cè)TCTE3mRNA和DNAH1mRN

9、A在兩組精子中的表達(dá)。
　　3、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以(x)±s表示。正常對(duì)照組與特發(fā)性弱精子癥組TCTE3、DNAH1蛋白和mRNA表達(dá)之間的比較，采用兩獨(dú)立樣本的t-檢驗(yàn)進(jìn)行分析;檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1、兩組精子中TCTE3蛋白的表達(dá)
　　兩組精子中TCTE3蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為:0.83±0.12、0.69±0.14，特發(fā)性弱精子癥組較正常

10、對(duì)照組相比，精子中TCTE3蛋白的表達(dá)量明顯下降(t=2.460，P=0.017)。
　　2、兩組精子中TCTE3mRNA的表達(dá)
　　兩組精子中TCTE3mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為:0.71±0.18、0.57±0.14，特發(fā)性弱精子癥組較正常對(duì)照組相比，精子中TCTE3mRNA的表達(dá)量明顯下降(t=3.038，P=0.005)。
　　3、兩組精子中DNAH1蛋白的表達(dá)
　　兩組精子中DNAH1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別

11、為:0.69±0.12、0.44±0.13，特發(fā)性弱精子癥組較正常對(duì)照組相比，精子中DNAH1蛋白的表達(dá)表達(dá)量明顯下降。(t=3.396，P=0.002)。
　　4、兩組精子中DNAH1mRNA的表達(dá)
　　兩組精子中DNAH1mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為:0.73±0.14、0.45±0.13，特發(fā)性弱精子癥組較正常對(duì)照組相比，精子中DNAH1mRNA表達(dá)量明顯下降(t=3.659,P=0.001)。
　　結(jié)論：