龜鹿二仙膠對去卵巢大鼠骨代謝的影響及機制研究.pdf

1、目的：
　　本課題采用動物實驗方法觀察龜鹿二仙膠對去卵巢大鼠骨代謝指標、力學性能和骨顯微結構的影響，進一步通過細胞實驗觀察其對rBMSCs增殖和成骨分化的作用并探討其作用機制，希望為臨床應用龜鹿二仙膠防治絕經后骨質疏松癥提供實驗依據(jù)，從微觀角度為“腎主骨”理論提供實驗支持。
　　方法：
　　1、去卵巢大鼠骨代謝、力學性能及骨顯微結構的改變及龜鹿二仙膠的干預作用
　　選用3月齡SD大鼠72只隨機分假手術組、模型組、

2、實驗組（龜鹿二仙膠高、中、低劑量組）和對照組（雷奈酸鍶組），每組各12只，除假手術組外其余各組均切除卵巢造模，造模后實驗組予以龜鹿二仙膠高、中、低劑量干預，對照組予以雷奈酸鍶干預，術后第12周取材。采用Elisa法檢測大鼠血清E2、 BALP、OC、TRACP-5b和尿DPD濃度，DEXA法測大鼠腰椎和股骨BMD，骨形態(tài)計量學方法分析大鼠腰椎、股骨髁部骨顯微結構的變化，腰椎壓縮和股骨三點彎曲方法檢測腰椎和股骨最大載荷，觀察龜鹿二仙膠對去

3、卵巢大鼠骨代謝、骨顯微結構和骨骼力學性能的影響。
　　2、龜鹿二仙膠含藥血清對rBMSCs增殖、成骨分化的影響
　　采用血清藥理學方法制備大鼠龜鹿二仙膠（用藥及劑量同實驗第一部分）含藥血清。全骨髓貼壁法分離rBMSCs，傳代培養(yǎng)至F3代并通過形態(tài)觀察、MTT法繪制生長曲線和FCM法檢測細胞表面標記物（CD45和CD90）鑒定。以F3代細胞為實驗對象，分別用濃度為10％含藥血清（高、中、低劑量組）、20％含藥血清（高、中、低劑

4、量組）、10％ FBS、10％和20％空白組血清干預，MTT法檢測細胞活性，F(xiàn)ACS法檢測細胞周期方法觀察龜鹿二仙膠含藥血清對rBMSCs增殖的影響，并確定促rBMSCs增殖含藥血清的最佳干預濃度。采用確定的最佳干預濃度的含藥血清干預F3代細胞，并用經典成骨誘導劑、10％FBS和10％空白血清為對照，分別于干預7、14和21d后，用ALP比活性檢測龜鹿二仙膠含藥血清對ALP活性的影響。干預21d后茜素紅(ARS)染色和RT-PCR方法檢

5、測rBMSCs種ALP、OC mRNA的表達。
　　3、龜鹿二仙膠含藥血清對Wnt/β-catenin信號通路的影響
　　用10％濃度的龜鹿二仙膠中劑量組含藥血清干預F3代rBMSCs21d后，分別用RT-PCR和Western-Blot方法檢測Wnt/β-catenin信號通路相關因子Wnt5a、Fzd-2、 Axin-2、β-catenin、Lef-1 mRNA和蛋白的表達。
　　結果：
　　1.去卵巢大鼠骨

6、代謝、力學性能及骨顯微結構的改變及龜鹿二仙膠的干預作用切除卵巢后，與假手術組相比，大鼠血清E2、BALP均顯著降低，血清OC和TRACP-5b尿DPD濃度均升高;腰椎及股骨BMD、最大載荷均顯著降低;腰椎和股骨Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N均顯著低于假手術組，TB.Sp則顯著高于假手術組，骨骼呈骨質疏松改變。
　　12周后，龜鹿二仙膠各劑量組和雷奈酸鍶組血清E2水平均顯著高于模型組，但不同劑量作用存在差異，高、低劑量組顯著高于中

7、劑量組和假手術組。龜鹿二仙膠中、高劑量組和雷奈酸鍶組OC和BALP水平顯著高于模型組，低、中劑量組BALP高于高劑量組。龜鹿二仙膠低劑量組血清TRACP-5b水平顯著降低，低、中劑量組尿DPD水平顯著降低，低于其余各組。龜鹿二仙膠中、高劑量組骨密度較模型組增高，但低于假手術組和雷奈酸鍶組。龜鹿二仙膠各劑量組腰椎和股骨最大載荷增高，對股骨最大載荷的作用各劑量組間差異不明顯，但中劑量組對腰椎最大載荷增高作用最顯著。與模型組比較，龜鹿二仙膠各

8、劑量組腰椎和股骨髁部Tb.Ar、Tb.Th和Tb.N顯著增高，Tb.Sp顯著降低，以中劑量作用最顯著。
　　2.龜鹿二仙膠含藥血清對rBMSCs增殖和成骨分化的影響
　　F3代rBMSCs呈均勻一致的長梭形，典型旋渦狀生長;MTT法繪制生長曲線，F(xiàn)CM法檢測F3代細胞CD45陽性表達率為1.46±0.23％，CD90陽性表達率為96.97±3.21％，符合BMSCs特征。MTT法和FACS檢測結果顯示龜鹿二仙膠含藥血清能明顯

9、促進F3代rBMSCs增殖，最佳干預條件是為10％濃度的龜鹿二仙膠中劑量組含藥血清。
　　以10％濃度的龜鹿二仙膠中劑量組含藥血清干預F3代細胞，第7d、14d和21d龜鹿二仙膠含藥血清組和經典誘導成骨組ALP比活性顯著高于胎牛血清組和空白血清組，且該兩組細胞ALP比活性隨培養(yǎng)天數(shù)增加升高更顯著，呈時間相關性，但兩組間ALP比活性無顯著性差異。21d時茜素紅染色可見龜鹿二仙膠含藥血清組和經典誘導成骨組中rBMSCs橘紅色鈣結節(jié)生成

10、，RT-PCR結果顯示該兩組rBMSCs的ALP和OCmRNA表達均顯著增高。
　　3.龜鹿二仙膠含藥血清對Wnt/β-catenin信號通路相關因子mRNA和蛋白表達的影響
　　RT-PCR結果顯示龜鹿二仙膠含藥血清組rBMSCs中Wnt5a、Fzd-2、β-catenin和VIILef-1 mRNA均顯著高于空白血清組和胎牛血清組，Axin-2 mRNA表達顯著低于其余各組。經典成骨誘導組Wnt5a和β-catenin

11、mRNA表達顯著高于胎牛血清組和空白血清組，與龜鹿二仙膠含藥血清組無顯著性差異;Fzd-2和Lef-1 mRNA表達與胎牛血清組和空白血清組無顯著性差異，顯著低于龜鹿二仙膠含藥血清組;Axin-2 mRNA的表達與胎牛血清組和空白血清組無顯著性差異，但顯著高于龜鹿二仙膠含藥血清組。
　　Western-Blot結果顯示龜鹿二仙膠含藥血清組rBMSCs中Wnt5a、Fzd-2、β-catenin和Lef-1蛋白表達均顯著高于空白血清

12、組和胎牛血清組，Axin-2蛋白表達顯著低于其余各組。經典成骨誘導組Wnt5a和β-catenin蛋白表達顯著高于胎牛血清組和空白血清組，與龜鹿二仙膠含藥血清組無顯著性差異;Fzd-2蛋白表達與胎牛血清組和空白血清組無顯著性差異，顯著低于龜鹿二仙膠含藥血清組;Axin-2蛋白表達顯著低于胎牛血清組和空白血清組，但顯著高于龜鹿二仙膠含藥血清組;Lef-1蛋白表達顯著高于胎牛血清組和空白血清組，但顯著低于龜鹿二仙膠含藥血清組。
　　結

13、論：
　　1.龜鹿二仙膠對去卵巢大鼠骨骼具有促進骨生成和抑制骨吸收的雙重作用，既增加骨密度，又同時增加骨小梁面積、寬度和節(jié)點數(shù)，明顯改善骨顯微結構，最終增強去卵巢大鼠骨強度。
　　2.10％濃度的龜鹿二仙膠中劑量組含藥血清能促進rBMSCs增殖，能通過增強Wnt/β-catenin信號通路相關因子wnt5a、β-catenin、Fzd-2、Lef-1活性，并抑制Axin-2活性，激活Wnt/β-catenin信號通路，從而促