龜鹿二仙膠及其拆方對大鼠軟骨細(xì)胞增殖與基質(zhì)合成的影響.pdf

1、目的:
　　 應(yīng)用體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),建立軟骨細(xì)胞培養(yǎng)體系。按單味藥研究方法將龜鹿二仙膠拆分為龜板、鹿角、人參和枸杞四味拆方,對比觀察龜鹿二仙膠全方及四味拆方對大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的作用,通過對其促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、Ⅱ型膠原以及蛋白黏多糖合成影響的觀察,從細(xì)胞、分子水平探討龜鹿二仙膠及其拆方對軟骨細(xì)胞的作用機(jī)制,闡述龜鹿二仙膠方君臣配伍關(guān)系的科學(xué)內(nèi)涵,為開發(fā)高效優(yōu)質(zhì)的中藥新藥提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.建

2、立軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系:采用酶消化方法分離原代軟骨細(xì)胞;倒置顯微鏡下觀察各代軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化;MTT法描繪各代軟骨細(xì)胞生長曲線,觀察細(xì)胞生長特性;甲苯胺藍(lán)染色結(jié)合Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色聯(lián)合鑒定軟骨細(xì)胞表型。
　　 2.MTT比色法檢測龜鹿二仙膠及其拆方含藥血清對軟骨細(xì)胞增殖的影響,并探討龜鹿二仙膠及其拆方含藥血清在不同灌胃劑量以及不同干預(yù)時間下對軟骨細(xì)胞增殖影響,篩選出各藥物劑量組含藥血清促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的最佳量效以及最佳

3、時效。
　　 3.免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測龜鹿二仙膠及其拆方含藥血清對軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)的影響。
　　 4.高碘酸希爾(PAS)染色法檢測龜鹿二仙膠及其拆方含藥血清對軟骨細(xì)胞中性黏多糖表達(dá)的影響。
　　 5.阿爾辛藍(lán)(AB)染色法檢測龜鹿二仙膠及其拆方對軟骨細(xì)胞酸性黏多糖表達(dá)的影響。
　　 6.PAS-AB法聯(lián)合染色檢測龜鹿二仙膠及其拆方對軟骨細(xì)胞蛋白黏多糖表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1

4、.成功分離并培養(yǎng)4周齡SD大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞;原代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞48h后外觀呈星狀形、不規(guī)則形,胞漿豐富,核仁清晰。組織形態(tài)學(xué)、甲苯胺藍(lán)染色和免疫細(xì)胞化學(xué)染色以及MTT描繪生長曲線結(jié)果顯示,軟骨細(xì)胞培養(yǎng)3代以內(nèi)可以良好維持表型的穩(wěn)定,傳4代以后開始出現(xiàn)去分化現(xiàn)象。
　　 2.MTT比色法篩選結(jié)果顯示:各藥物組在24h、48h、72h對軟骨細(xì)胞的增殖效應(yīng)均不隨劑量呈比例遞增趨勢,其中以中劑量藥物組干預(yù)軟骨細(xì)胞48h促增殖藥效最佳,選

5、取作為促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的最佳量效以及最佳時效并作為后續(xù)試驗(yàn)干預(yù)方案;48h時,OTL(OTL)組和全方組均可非常顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖(P＜0.01),鹿角組和龜板組均可顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖(P＜0.05),人參組和枸杞組對軟骨細(xì)胞增殖作用無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);與全方組比較,OTL組有顯著差異(P＜0.05);鹿角組或龜板組均具有顯著差異(P＜0.05),人參組或枸杞組均具有非常顯著差異(P＜0.01);各拆方組比較,鹿角組或龜板

6、組與人參組或枸杞組比較均具有顯著差異(P＜0.05),鹿角組與龜板組比較、人參組與枸杞組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 3.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:各組標(biāo)本均可見Ⅱ型膠原表達(dá),表達(dá)部位為胞漿,可見棕黃色顆?；虺蓤F(tuán)片狀。OTL組與全方組均可非常顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)(P＜0.01);鹿角組或龜板組均可顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)(P＜0.05);人參組或枸杞組對促進(jìn)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);

7、與全方組比較,OTL組有顯著差異(P＜0.05);鹿角組或龜板組均呈顯著差異(P＜0.05),人參組或枸杞組均呈非常顯著差異(P＜0.01);各拆方組比較,鹿角組或龜板組與人參組或枸杞組比較有顯著差異(P＜0.05),鹿角組與龜板組比較、人參組與枸杞組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 4.PAS法染色結(jié)果顯示:各組標(biāo)本均可見中性黏多糖表達(dá),表達(dá)部位為軟骨基質(zhì)與細(xì)胞周圍,可見紫紅色顆?；虺蓤F(tuán)片狀,OTL組與全方組均可非常

8、顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞中性黏多糖表達(dá)(P＜0.01);鹿角組或龜板組均可顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞中性黏多糖的表達(dá)(P＜0.05);人參組或枸杞組對促進(jìn)軟骨細(xì)胞中性黏多糖的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05):與全方組比較,OTL組具有顯著差異(P＜0.05);鹿角組或龜板組均呈顯著差異(P＜0.05),人參組或枸杞組均呈非常顯著差異(P＜0.01);各拆方組比較,鹿角組或龜板組與人參組或枸杞組比較有顯著差異(P＜0.05),鹿角組與龜板組比較、人參組與枸

9、杞組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 5.AB法染色結(jié)果顯示:各組標(biāo)本均可見酸性黏多糖表達(dá),表達(dá)部位為細(xì)胞核與胞核周圍,可見胞核呈深藍(lán)色異染,胞核周圍呈淡藍(lán)色異染,OTL組與全方組均可非常顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞酸性黏多糖表達(dá)(P＜0.01);鹿角組或龜板組均可顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞酸性黏多糖的表達(dá)(P＜0.05);人參組或枸杞組對促進(jìn)軟骨細(xì)胞酸性黏多糖的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);與全方組比較,OTL組呈顯著差異(P＜0.0

10、5);鹿角組或龜板組均呈顯著差異(P＜0.05),人參組或枸杞組均呈非常顯著差異(P＜0.01);各拆方組比較,鹿角組或龜板組與人參組或枸杞組比較有顯著差異(P＜0.05),鹿角組與龜板組比較、人參組與枸杞組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 采用酶消化法分離培養(yǎng)的大鼠軟骨細(xì)胞,在3代以內(nèi)可良好維持細(xì)胞表型,符合軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性;龜鹿二仙膠及其拆方含藥血清對軟骨細(xì)胞的增殖均不隨劑量以及干預(yù)時間呈比

11、例遞增趨勢,以中劑量含藥血清干預(yù)48h時促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖藥效最佳;龜鹿二仙膠可非常顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖以及Ⅱ型膠原和蛋白黏多糖的合成,全方藥效顯著優(yōu)于各拆方,與陽性對照組藥物OTL具有類似藥效;拆方龜板、鹿角均可有效促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖以及Ⅱ型膠原和蛋白黏多糖的合成;人參、枸杞對軟骨細(xì)胞增殖以及Ⅱ型膠原和蛋白黏多糖的合成均無明顯促進(jìn)作用;說明龜板、鹿角是全方中發(fā)揮主要作用的藥物,顯示出了君藥的重要地位;提示龜板和鹿角均可能含有某類可直接刺激