秀麗隱桿線蟲對銅的解毒代謝機(jī)制研究.pdf

1、銅是維持生物體正常生理活動(dòng)所必需的微量元素，其缺乏或過量都會(huì)引起嚴(yán)重的身體缺陷和病癥，如免疫功能下降、引起糖尿病、冠心病、高脂血癥、骨質(zhì)疏松和腫瘤等。對銅代謝遺傳病肝豆?fàn)詈俗冃裕ㄣ~中毒）的治療多采用二巰基丙磺酸鈉、青霉胺、曲鋅制劑和四硫鋁酸鹽等驅(qū)銅劑進(jìn)行醫(yī)治，或采用還原劑谷胱甘肽以減輕過量銅對機(jī)體的氧化損傷，但該治療手段僅能局部緩解癥狀，并不能從根本上治愈該疾病，且常會(huì)惡化神經(jīng)癥狀。因此深入研究銅代謝解毒機(jī)理，有效降低機(jī)體內(nèi)銅含量，是治

2、愈該病癥的重要途徑。同時(shí)，隨著社會(huì)和工業(yè)的發(fā)展，越來越多的銅排入環(huán)境中，農(nóng)田環(huán)境中過量銅可破壞土壤的物理化學(xué)性質(zhì)，抑制農(nóng)作物生長，減少產(chǎn)量和養(yǎng)分，過量銅還可通過食物鏈進(jìn)一步危害人類健康，所以了解銅在生物體的代謝規(guī)律和及解毒機(jī)制將有助于銅中毒的治療和銅污染土壤的生物修復(fù)。目前，雖然已有研究顯示在生物體內(nèi)由銅、sp1（銅感受器）和hctr1（銅吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）共同調(diào)節(jié)銅的穩(wěn)態(tài)，但是多細(xì)胞生物體內(nèi)銅代謝的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)途徑尚不清楚。
　　秀麗隱

3、桿線蟲作為經(jīng)典的模式生物已廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、毒理學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等方面的研究。本文以模式生物秀麗隱桿線蟲為研究對象，從銅對秀麗隱桿線蟲的毒性效應(yīng)、抗氧化酶系在銅代謝解毒過程中的作用、腸道銅吸收基因的篩選和鑒定、抗銅突變體篩選和基因定位及秀麗隱桿線蟲對銅的行為變化等幾方面研究秀麗隱桿線蟲對銅的代謝解毒機(jī)制，主要研究內(nèi)容如下：
　　一、銅對秀麗隱桿線蟲的毒性效應(yīng)
　　本文系統(tǒng)研究了過量銅對秀麗隱桿線蟲的毒性效應(yīng)。研究結(jié)

4、果顯示，過量銅可對線蟲造成多重生物學(xué)毒性效應(yīng)，包括表皮褶皺、產(chǎn)卵孔萎縮、生殖腺萎縮、產(chǎn)卵率降低、發(fā)育延遲和發(fā)育異常等。同時(shí)本文發(fā)現(xiàn)秀麗隱桿線蟲卵在母蟲體內(nèi)孵化的袋線蟲（Bags-of-worms）表型是銅毒性效應(yīng)的結(jié)果，袋線蟲的形成提高了后代的成活率。秀麗隱桿線蟲對過量銅的表型變化可作為毒性效應(yīng)觀察分析的直接指標(biāo)，并應(yīng)用于本文對秀麗隱桿線蟲銅突變體的正向和反向遺傳篩選實(shí)驗(yàn)中。
　　二、秀麗隱桿線蟲抗氧化酶系在對過量銅解毒代謝中的作

5、用
　　銅對機(jī)體的危害主要是氧化損傷，因此抗氧化酶在銅的解毒代謝過程中發(fā)揮著重要作用。本文采用酶活測定、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和遺傳突變體等方法，檢測了過量銅所引發(fā)的線蟲體內(nèi)抗氧化酶活性及其基因表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示，SOD（超氧化物歧化酶）在0.1、0.2、0.4mmol/L CuSO4處理下活性最高，CAT（過氧化氫酶）在0.1、0.2、0.4和0.8mmol/L CuSO4處理下活性最高，GPX（谷胱甘肽過氧化物酶）則隨著CuS

6、O4濃度的增高，活性越趨升高，而GST（谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶）的活性則下降。對SOD、CAT和GPX mRNA表達(dá)量的進(jìn)一步研究表明SOD-3、SOD-5、CTL-1、CTL-2、GPX-1、GPX-2、GPX-3、GPX-4、GPX-6、GPX-7、GPX-8基因的表達(dá)量顯著升高。而sod-5，ctl-1，gpx-3，gpx-4，gpx-6缺失突變體的LC50顯著降低，表明在銅解毒過程中上述基因具有重要的生理功能。同時(shí)過表達(dá)SOD-1、

7、SOD-2、SOD-3或CAT均可增加秀麗隱桿線蟲對銅的抗性，表明非銅應(yīng)答抗氧化酶也參與到消除過量銅引起的氧化損傷過程。
　　三、秀麗隱桿線蟲胰島素信號(hào)通路的抗銅特性分析
　　已知胰島素/胰島素樣生長因子（Insulin/IGF-1）信號(hào)通路，作為抗氧化酶的負(fù)調(diào)控因子，不僅與秀麗隱桿線蟲的壽命相關(guān)，同時(shí)也參與抗逆性生理功能。本文采用酶活測定、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和遺傳突變體等方法研究了daf-2和age-1突變體抗氧化酶系對銅

8、的應(yīng)答和對銅的敏感性，結(jié)果表明上述突變體不僅可以延長蟲體的壽命，同時(shí)也增強(qiáng)了蟲體抗銅性。當(dāng)與daf-16雙突變后，銅抗表型減弱或消失，說明其抗性主要通過daf-16介導(dǎo)的；daf-2的抗性顯著高于age-1的抗性，推測在daf-2的下游還有平行于age-1的通路存在；同時(shí)這些突變體內(nèi)的SOD、CAT和GPX活性仍然可以被過量銅誘導(dǎo)提高，daf-2突變體中，SOD-3、SOD-5和CTL-1基因可被過量銅誘導(dǎo)，提高表達(dá)量；age-1突變體

9、中，SOD-4、CTL-1、CTL-2、CTL-3、GPX-1和GPX-8基因可被過量銅誘導(dǎo)表達(dá)；daf-16突變體中，SOD-2、SOD-4、SOD-5、GPX-1和GPX-8基因可被過量銅誘導(dǎo)表達(dá)，在daf-2、age-1、daf-16突變體中，不同的抗氧化酶基因參與了過量銅的應(yīng)答，表明其是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)接觸抑制因子后，各種激活調(diào)控因子協(xié)同作用，以提高抗氧化酶的活性，緩解過量銅引起的氧化損傷。
　　四、秀麗隱桿線蟲抗銅

10、基因的克隆、定位及功能研究
　　目前已知，細(xì)胞吸收銅離子的蛋白為CTR（銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白），但是對于CTR在腸道細(xì)胞中的定位及是否參與人腸道銅吸收轉(zhuǎn)運(yùn)還存在爭議。在秀麗隱桿線蟲中雖有10個(gè)同源基因，但是其分子特性和功能還未準(zhǔn)確鑒定。本文對這10個(gè)基因進(jìn)行反向遺傳篩選，其中2個(gè)基因在RNAi之后，秀麗隱桿線蟲增強(qiáng)了對銅的抗性，分別命名為ctr-1和ctr-2。構(gòu)建其上游2k調(diào)控序列和C端GFP（Green fluorescent prot

11、ein）融合表達(dá)蛋白轉(zhuǎn)基因品系，發(fā)現(xiàn)CTR-1位于腸道細(xì)胞頂端膜上，CTR-2位于腸道細(xì)胞質(zhì)囊泡上。ctr-1和ctr-2突變體增強(qiáng)了蟲體對銅的抗性，而過表達(dá)轉(zhuǎn)基因品系可增強(qiáng)對銅的敏感性，因此ctr-1可能直接參與秀麗隱桿線蟲腸道銅的吸收，CTR-2可能間接參與蟲體腸道銅的吸收。這一結(jié)果表明CTR-1可能定位于秀麗隱桿線蟲腸道細(xì)胞頂端膜上，從食物中吸收銅離子。
　　五、秀麗隱桿線蟲抗銅突變體的篩選與SNP定位
　　為了進(jìn)一步

12、探索多細(xì)胞生物體內(nèi)銅代謝的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，本文采用正向遺傳方法篩選銅抗突變體。首先銅影響線蟲的正常發(fā)育，這一表型可實(shí)現(xiàn)在體式顯微鏡下對線蟲銅抗突變體的大規(guī)模篩選。確定篩選培養(yǎng)基的濃度，通過氨基磺酸乙酯（EMS）誘變L4時(shí)期的線蟲P0，F(xiàn)2卵放在篩選培養(yǎng)基上，進(jìn)行大規(guī)模（約10萬個(gè)雜合基因組）的篩選，得到2個(gè)抗銅突變體ms1和ms2。在篩選培養(yǎng)基上野生型停止發(fā)育，而抗銅突變體則可發(fā)育到成蟲，且抗銅性狀能穩(wěn)定遺傳。與N2的回交實(shí)驗(yàn)表明，ms1

13、的抗銅表型可能由單基因隱性突變導(dǎo)致，ms2的抗銅表型消失，可能是由多基因突變所引起。以CB4856和ms1作親本，構(gòu)建了F2群，經(jīng)SNP定位，確定ms1突變位點(diǎn)位于LG:II號(hào)染色體上，進(jìn)一步對LG:II號(hào)染色體上的8個(gè)SNP標(biāo)記進(jìn)行分析，將ms1的突變位點(diǎn)定位在LG:II,-6附近。已經(jīng)報(bào)道的與銅抗有關(guān)的基因均不在這個(gè)區(qū)域，因此其可能是新的基因或已知基因新的功能。秀麗隱桿線蟲抗銅突變體ms1的篩選和定位可為深入研究線蟲銅代謝及調(diào)控的分

14、子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　六、CTR-3可能參與秀麗隱桿線蟲對銅的趨避性行為
　　為了闡明秀麗隱桿線蟲線蟲對銅趨避行為的分子機(jī)制及其他CTR基因的功能，本文采用反向遺傳篩選方法獲得介導(dǎo)秀麗隱桿線蟲對銅趨避行為的基因ctr-3，當(dāng)其表達(dá)量降低時(shí)線蟲對銅的趨避指數(shù)顯著降低，同時(shí)對奎寧的趨避指數(shù)也隨之降低，但對組氨酸的趨向指數(shù)并未產(chǎn)生顯著變化。構(gòu)建其自身2k調(diào)控區(qū)和C端綠色熒光蛋白融合蛋白研究顯示，其在趨避神經(jīng)元ASH中也有表達(dá)，