MicroRNAs對秀麗隱桿線蟲異氟烷敏感性的影響.pdf

1、目的:
　　1.通過秀麗線蟲行為學(xué)實驗,篩選與麻醉藥異氟烷敏感性作用相關(guān)的microRNAs突變體。
　　2.構(gòu)建microRNAs的轉(zhuǎn)錄報告基因,獲得秀麗線蟲microRNAs的時空表達特點。
　　方法:
　　1.行為學(xué)實驗-RadialDispersionAssay:協(xié)調(diào)性運動(coordinatemovement)通過放射分散實驗進行測試。整個實驗使用同樣大小、食物充足的秀麗線蟲(即產(chǎn)卵后72h),在室溫2

2、0°培養(yǎng)。
　　分組情況如下:對照組:野生型線蟲N2,分為不加異氟烷和加入不同濃度的(0.3％,0.6%,0.8%,1.1%)異氟烷處理。實驗組:突變線蟲(che-2,unc-55,unc-104,daf-2,unc-25,unc-53,unc-30,daf-16,daf-2,daf-16,lin-4,haf-2,eri-1;lin-15,eri-3,eri-9,alg-1,alg-2,ccIs4251;gsIs234,lin-1

3、5B;uIs57,sid-1;uIs69,sid-1him-5;lin-15B,oig-1,ergo-1,rde-1,rde-4,dcr-1,nrde-3,mir-1,mir-2,mir-24,mir-32,mir-46,mir47,nDf49,mir-51,mir52,nDf52,mir-54&mir-55&mir-56,mir-58,nDf59,nDf60,mir-63,nDf63;mir-63,nDf64,mir-67,mir-7

4、0,mir-75,mir-76,mir-77,mir78,mir79,mir-80,mir-81&mir-82,mir-83,mir-84,mir-85,mir-228,mir-230,mir-231,mir-234,mir-235,mir-238,mir-240,mir-240&mir-786,mir-241,mir-241&mir-84,mir-243,mir-244,mir-245,mir-246,mir-247&mir-797,

5、mir-251,mir-252,mir-254,mir-256,mir-257,mir-260,mir-261,mir-268,mir-269,mir-270,mir-359)分為不加異氟烷和加入不同濃度的(0.3%,0.6%,0.8%,1.1%)異氟烷處理。計算不同處理下的線蟲分散指數(shù),并觀察加入不同濃度異氟烷后分散指數(shù)的變化趨勢。再比較野生型線蟲N2和突變線蟲對異氟烷敏感性變化的差異。兩種不同處理下的實驗各重復(fù)三次。
　　2.

6、行為學(xué)實驗-Egg-layingDefective:整個實驗使用同樣大小、食物充足的秀麗線蟲(即產(chǎn)卵后72h),在室溫20°培養(yǎng)。
　　分組情況如下:對照:野生型線蟲N2,分為不加異氟烷和加入1.7%異氟烷處理。實驗組:dcr-1突變線蟲和55種microRNA突變線蟲(mir-1,mir-2,mir-24,mir-32,mir-46,mir47,nDf49,mir-51,mir52,nDf52,mir-54&mir-55&mir

7、-56,mir-58,nDf59,nDf60,mir-63,nDf63;mir-63,nDf64,mir-67,mir-70,mir-75,mir-76,mir-77,mir78,mir79,mir-80,mir-81&mir-82,mir-83,mir-84,mir-85,mir-228,mir-230,mir-231,mir-234,mir-235,mir-238,mir-240,mir-240&mir-786,mir-241,mi

8、r-241&mir-84,mir-243,mir-244,mir-245,mir-246,mir-247&mir-797,mir-251,mir-252,mir-254,mir-256,mir-257,mir-260,mir-261,mir-268,mir-269,mir-270,mir-359),均分為不加異氟烷和加入1.7vol%異氟烷處理。比較兩組在相同處理下產(chǎn)卵缺陷表型的比率,及對異氟烷敏感性變化的差異。兩組不同處理下的實驗各重

9、復(fù)三次。
　　3.構(gòu)建對異氟烷敏感的microRNA相關(guān)的轉(zhuǎn)錄報告基因即PmirRNA::gfp,然后將質(zhì)粒DNA顯微注射至線蟲性腺,然后通過激光掃描共聚焦顯微鏡確定秀麗線蟲microRNAs的時空表達特點。
　　結(jié)果:
　　1.應(yīng)用放射分散實驗篩選上述所有突變秀麗線蟲。無異氟烷處理的情況下,突變線蟲與野生型線蟲的分散指數(shù)無顯著性差異。在0.3%,0.6%和0.8%異氟烷處理下,相較于野生型線蟲N2,dcr-1突變線蟲

10、分散指數(shù)顯著下降,表現(xiàn)出更為明顯的協(xié)調(diào)性運動失調(diào),說明dcr-1突變線蟲對異氟烷更加敏感(P<0.05)。在0.6%,0.8%和1.1%異氟烷處理下,與野生型線蟲N2比較,eri-3突變線蟲分散指數(shù)顯著下降,表現(xiàn)出更為明顯的協(xié)調(diào)性運動失調(diào),說明eri-3突變線蟲對異氟烷更加敏感(P<0.05)。在0.3%,0.6%和1.1%異氟烷處理下,相較于野生型線蟲N2來說,隨機篩選的6種microRNA突變線蟲即mir-83,mir-240&mi

11、r-786,mir-77,mir-257,mir-75,mir-241分散指數(shù)下降更加明顯,產(chǎn)生顯著的協(xié)調(diào)性運動失調(diào),即對異氟烷的反應(yīng)是更加敏感(P<0.05)。我們初步推斷上述microRNA突變線蟲暴露于一定濃度異氟烷下,都會表現(xiàn)出顯著的協(xié)調(diào)性運動失調(diào)。
　　2.對dcr-1突變和55種microRNA突變的線蟲產(chǎn)卵缺陷實驗篩選結(jié)果如下:在1.7%異氟烷處理下,相較于野生型線蟲N2,dcr-1和8種micrRNA突變的線蟲即m

12、ir-241&mir-84,mir-63,mir-77,mir-2,mir-247&mir-797,mir-80,mir-46,nDf63;mir-63表現(xiàn)出顯著的產(chǎn)卵缺陷,即對異氟烷更加敏感(P<0.05)。在無異氟烷處理的情況下,與野生型線蟲N2相比,mir-2和mir-63本身就具有產(chǎn)卵缺陷的表型,可排除。6種即mir-241&mir-84,mir-77,mir-247&mir-797,mir-80,mir-46,nDf63;mi

13、r-63突變體是對異氟烷敏感的microRNA突變線蟲。(P<0.05)。
　　3.時空表達特點:mir-80在位于近咽部和近尾部的神經(jīng)元上及體壁肌肉上表達,mir-84在位于近咽部和近尾部的神經(jīng)元上表達,mir-797在近咽部、蟲體中部和近尾部神經(jīng)元分布。
　　結(jié)論:
　　1.通過RadialDispersionAssay篩選發(fā)現(xiàn):dcr-1,eri-3和microRNAs突變線蟲表現(xiàn)出對異氟烷敏感性增強,產(chǎn)生顯著的

14、協(xié)調(diào)性運動失調(diào)的表型。
　　2.通過Egg-layingDefective篩選發(fā)現(xiàn):dcr-1和6種特異的microRNAs(mir-241&mir-84,mir-77,mir-247&mir-797,mir-80,mir-46,nDf63;mir-63)突變線蟲表現(xiàn)出對異氟烷敏感性增強,產(chǎn)生顯著的產(chǎn)卵缺陷的表型。
　　3.時空表達特點:mir-80在位于近咽部和近尾部的神經(jīng)元上及體壁肌肉上表達,mir-84在位于近咽部和近