逆轉糖酵解-基于糖代謝的肝癌治療新策略研究.pdf

1、目的:饑餓狀態(tài)下機體的肝細胞通過糖異生來保證重要器官的葡萄糖供給。惡性轉化的肝細胞是否還具有糖異生的能力目前尚不清楚。有氧糖酵解是惡性腫瘤的重要標志,除了三步不可逆反應外,糖異生的其余七步反應均是糖酵解的逆反應,因此可以說糖異生拮抗糖酵解。本研究將探討人和小鼠肝癌組織中糖異生的變化及相應的肝癌治療策略。
　　方法:(1)Real-time PCR和免疫組化分析10例肝癌病人肝癌組織中糖異生的限速酶PEPCK、G6Pase和調控糖皮

2、質激素的兩個關鍵酶11β-HSD1、11β-HSD2的表達,進一步免疫組化分析58例肝癌病人的肝癌組織和癌旁組織中11β-HSD1和11β-HSD2的表達,并統(tǒng)計分析11β-HSD1/11β-HSD2的比值與肝癌病人的生存時間和腫瘤復發(fā)率的關系。
　　(2)RT-PCR、Western blot和免疫組化分析小鼠肝癌組織中PEPCK、G6Pas、11β-HSD1和11β-HSD2的表達,進一步建立高表達11β-HSD1或下調11β

3、-HSD2的肝癌細胞,并將高表達11β-HSD1或下調11β-HSD2的肝癌細胞接種小鼠進行腫瘤生長實驗,驗證11β-HSD1和11β-HSD2對肝癌生長的影響,并采用RT-PCR檢測相應高表達11β-HSD1或下調11β-HSD2的肝癌組織中PEPCK和G6Pase的表達,以探討糖異生對肝癌生長的影響。
　　(3)體外條件下,分別用0μM、0.1μM、1μM、10μM地塞米松處理H22細胞一周后,RT-PCR和Western b

4、lot檢測PEPCK和G6Pase的表達并檢測胞內葡萄糖的變化。體內條件下,皮下接種H22細胞至BALB/c右背側,4天后隨機分為四組(6只/組),分別腹腔注射0μg/g、1.25μg/g、2.5μg/g和5μg/g地塞米松,觀察并記錄腫瘤生長情況,16天后處死小鼠分離肝癌組織,RT-PCR和Western blot檢測PEPCK和G6Pase的表達并檢測組織內葡萄糖的變化。為排除不同接種部位對地塞米松治療效果的影響,建立小鼠原位肝癌模

5、型,隨機分為四組(6只/組)分別腹腔注射0μg/g、1.25μg/g、2.5μg/g和5μg/g地塞米松,16天后處死小鼠,觀察腫瘤大小。為探討對地塞米松對非肝臟來源的腫瘤的影響,皮下接種B16細胞至C57BL/6右背側,4天后隨機分為四組(6只/組),分別腹腔注射0μg/g、1.25μg/g、2.5μg/g和5μg/g地塞米松,觀察并記錄腫瘤生長情況;為探討地塞米松治療腫瘤的機制,采用PEPCK抑制劑3-MPA和地塞米松聯(lián)合治療H22

6、皮下瘤小鼠,觀察并測量腫瘤生長情況;最后利用非活性形式的糖皮質激素潑尼松體外處理H22細胞,體內治療H22皮下瘤小鼠,RT-PCR分析PEPCK和G6Pase的表達并記錄腫瘤生長情況。
　　(4)皮下接種H22細胞至BALB/c右背側,4天后隨機分為四組(6只/組),分別腹腔注射0μg/g、1.25μg/g、2.5μg/g和5μg/g地塞米松,16天后處死小鼠分離肝癌組織,RT-PCR檢測一系列代謝相關基因(HK2,PFK1,PK

7、M2,LDHA,PDHA1,CS,SDHA,ACL,ACC,HMGCR,G6PD,GPD1)的表達,Real-time PCR和Western blot進一步檢測中LDH和GPD1的表達并檢測腫瘤組織內乳酸的水平。
　　結果:(1)肝癌病人肝癌組織中糖異生限速酶PEPCK、G6Pase表達顯著下調,調控糖皮質激素的關鍵酶11β-HSD1表達下調,而11β-HSD2表達上調,且肝癌病人中11β-HSD1和11β-HSD2在癌旁組織和

8、肝癌組織中表達呈逆關聯(lián),即癌旁組織中11β-HSD1表達高、11β-HSD2表達低,而肝癌組織恰與此相反11β-HSD1表達低、11β-HSD2表達高,進一步統(tǒng)計結果顯示11β-HSD1/11β-HSD2比值與肝癌病人總體生存時間與復發(fā)率相關。
　　(2)小鼠肝癌組織中PEPCK和G6Pase表達顯著下調,糖異生喪失,11β-HSD1表達下調,而11β-HSD2表達上調,恢復小鼠肝癌細胞H22中11β-HSD1和11β-HSD2的

9、表達后,小鼠腫瘤生長變慢且腫瘤組織內PEPCK和G6Pase表達上調。
　　(3)體外條件下,地塞米松可上調H22細胞中PEPCK和G6Pase的表達并上調胞內葡萄糖含量,體內條件下,地塞米松可抑制皮下瘤肝癌和原位肝癌的生長并上調肝癌組織內的PEPCK和G6Pase的表達和相應的葡萄糖含量,但是對小鼠黑色素瘤無影響,揭示地塞米松對肝癌治療的特異性,同時利用PEPCK的抑制劑3-MPA可阻斷地塞米松對肝癌的抑制作用,揭示地塞米松可能

10、是通過糖異生途徑抑制肝癌,且非活性形式的糖皮質激素潑尼松體外對H22的PEPCK和G6Pase表達無影響,體內對小鼠皮下瘤無抑制作用。
　　(4)地塞米松治療后小鼠肝癌組織中LDH和GPD1表達下調且相應組織內乳酸水平降低。
　　結論:人和小鼠肝癌細胞中調控糖皮質激素的關鍵酶11β-HSD1和11β-HSD2表達逆轉,導致內源性糖皮質激素的失活和糖異生的喪失。11β-HSD1/11β-HSD2的比值與肝癌病人的生存時間和腫瘤