Ca2+-CaM及CDPK在干旱高溫復(fù)合脅迫誘導(dǎo)玉米sHSPs表達(dá)增加中的作用.pdf

1、sHSPs（小熱休克蛋白）在植物的生命活動(dòng)中扮演著重要角色。我們之前的研究顯示：sHSP26、sHSP22、sHSP17.4、sHSP17.2在高溫及高溫干旱條件下顯著誘導(dǎo)表達(dá)，在正常及干旱條件下不表達(dá)，并且證明了sHSP26位于葉綠體內(nèi)，能夠與葉綠體內(nèi)6個(gè)蛋白相互作用，保護(hù)PSII活性。此外，我們的研究進(jìn)一步證明了，外源H2O2能夠顯著誘導(dǎo)sHSP26的表達(dá)，有助于提高植物耐逆性。但是，目前對Ca2+/CaM、CDPK是否參與sHSP

2、26、sHSP22、sHSP17.4的表達(dá)并不清楚，因此，本研究采用玉米品種鄭單958為實(shí)驗(yàn)材料，利用RT-PCR，Western Blotting，瞬時(shí)RNA干擾（RNAi）等技術(shù)，確定Ca2+/CaM、CDPK在干旱高溫復(fù)合脅迫誘導(dǎo)sHSP26、sHSP22、sHSP17.4的表達(dá)中的作用。主要結(jié)果如下：
　　1、為了確定sHSP26、sHSP22及sHSP17.4表達(dá)的特性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。選定了兩個(gè)溫度，42℃和44℃，

3、在每個(gè)溫度條件下，分別對幼苗進(jìn)行高溫處理0h(對照)、2h、4h、6h、8h、10h.RT-PCR及Western Blotting技術(shù)分析結(jié)果顯示，sHSP26、sHSP22、sHSP17.4的基因表達(dá)量在高溫脅迫下明顯上調(diào)；高溫脅迫2h時(shí)表達(dá)量最為豐富，隨著時(shí)間的推移，表達(dá)量逐漸減少；44℃時(shí)表達(dá)量要略高于42℃脅迫處理的。而sHSP26蛋白表達(dá)水平在高溫處理4h時(shí)表達(dá)量較為豐富，隨著脅迫時(shí)間延長表達(dá)量逐漸降低，且在44℃時(shí)的表達(dá)水

4、平高于42℃的。以上結(jié)果說明，sHSP26、sHSP22、sHSP17.4均為高溫誘導(dǎo)蛋白，并且44℃條件下2h對其基因誘導(dǎo)效果較為明顯，4h對蛋白誘導(dǎo)效果較為明顯，所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中研究基因表達(dá)水平時(shí)采用44℃，2h對植株脅迫處理，研究蛋白表達(dá)水平時(shí)采用44℃，4h對植株脅迫處理。
　　2、分別使用0mM、1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、30mM CaCl2對幼苗的根部預(yù)處理8小時(shí)，然后置于44℃分別進(jìn)行2h和4h處

5、理。結(jié)果如下：在高溫脅迫條件下，sHSP22、sHSP17.4的表達(dá)量隨著CaCl2濃度的變化先增加后降低，并且10mM CaCl2對兩者的誘導(dǎo)作用比較明顯。sHSP26的表達(dá)量隨CaCl2濃度的變化整體上呈降低趨勢，并且在CaCl2濃度為10mM和30mM時(shí)，降低趨勢較為明顯，在蛋白水平上經(jīng)CaCl2預(yù)處理以后，sHSP26的表達(dá)量隨CaCl2濃度的增大逐漸減少，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)選定10mM CaCl2對植株進(jìn)行預(yù)處理。
　　3、分

6、別采用了Ca2+誘導(dǎo)劑CaCl2、Ca2+螯合劑EGTA、CaM抑制劑W7和TFP對植株進(jìn)行處理。結(jié)果顯示：CaCl2預(yù)處理以后，sHSP26及基因的表達(dá)量減少，sHSP22、sHSP17.4的表達(dá)量明顯增加。EGTA、W7、TFP預(yù)處理以后，sHSP26及基因、sHSP22、sHSP17.4的表達(dá)量都明顯減少，并且EGTA和W7明顯降低了sHSP26磷酸化程度。以上結(jié)果說明CaM參與了sHSP26、sHSP22、sHSP17.4的表達(dá)

7、及sHSP26磷酸化。
　　4、CDPK作為Ca2+受體，在植物體內(nèi)扮演著重要角色。在本研究中利用同源比對等技術(shù)篩選出CDPK1(ID:542762)、CDPK1(ID:542526)、CK3(ID:101061019)、CDPK AK1同工酶(ID:100285166)、CDPK(ID:542226)）作為研究對象，探索CDPK與sHSP26、sHSP22、sHSP17.4之間關(guān)系。在研究過程中發(fā)現(xiàn)CDPK AK1同工酶與sHS

8、P26的表達(dá)特性之間有類似之處：在高溫條件下sHSP26和CDPK同工酶顯著表達(dá)，經(jīng)CaCl2處理以后，表達(dá)量都有所下降，所以后期選擇CDPK AK1同工酶，制定了瞬時(shí)沉默系統(tǒng)，研究其與sHSP26、sHSP22、sHSP17.4的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)CDPK AK1
　　同工酶沉默以后sHSP26、sHSP22、sHSP17.4的表達(dá)量明顯下降，此結(jié)果表明，CDPK AK1同工酶參與了sHSP26、sHSP22、sHSP17.4的表達(dá)