舒郁膠囊對大鼠海馬神經(jīng)元5-HT3受體表達(dá)及其介導(dǎo)的Ca2+-CaM通路的作用.pdf

1、目的:觀察舒郁膠囊及其君藥柴胡的抗抑郁作用,通過離體實(shí)驗(yàn)研究,結(jié)合血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,以大鼠海馬神經(jīng)元中5-HT3受體作為研究對象,初步探索抑郁情緒發(fā)病的微觀作用機(jī)制,并試圖明確調(diào)肝方藥舒郁膠囊的相應(yīng)作用靶點(diǎn)。方法:運(yùn)用無血清培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng);制備各組大鼠血清,在中藥血清藥理學(xué)的指導(dǎo)下,實(shí)驗(yàn)共分為三個部分:1.采用孤養(yǎng)結(jié)合慢性溫和刺激復(fù)制抑郁情緒大鼠模型,以調(diào)肝方藥舒郁膠囊及其君藥柴胡的提取物進(jìn)行藥物干預(yù),氟西汀作為陽

2、性藥物對照,制備各組大鼠血清,分別加入體外培養(yǎng)新生大鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)基中孵育24h,采用蛋白印跡技術(shù)(Western blot)和細(xì)胞免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence, IF)分別檢測神經(jīng)元中5-HT3A受體和5-HT3B受體蛋白水平的表達(dá)。2.采用與實(shí)驗(yàn)一相同的方法制備血清,在此基礎(chǔ)上運(yùn)用熒光探針fluo-3/AM標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子,利用激光共聚焦顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度的變化及各組海馬神經(jīng)元中

3、CaM受體蛋白水平表達(dá)量的變化,進(jìn)一步研究舒郁膠囊及其君藥柴胡對5-HT3R-Ca2+-CaM通路的影響。3.制備一定濃度的舒郁膠囊和柴胡含藥血清,利用激動劑激活5-HT3受體信號通路,將5-HT3受體信號通路中的Ca2+-CaM體系單獨(dú)作為研究對象,觀察海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度和CaM受體蛋白水平表達(dá)量的變化,探索舒郁膠囊及其君藥柴胡對5-HT3受體介導(dǎo)的Ca2+-CaM受體蛋白信號通路的作用。結(jié)果:1.Western blo

4、t和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常組比較,抑郁情緒模型大鼠血清處理的神經(jīng)元胞內(nèi)5-HT3A受體和5-HT3B受體蛋白表達(dá)量均顯著性升高(P＜0.05);與模型組比較,用藥治療組血清處理的神經(jīng)元5-HT3A受體表達(dá)量顯著性降低(P＜0.05),趨向于正常水平,舒郁膠囊治療組、柴胡治療組和氟西汀治療組之間無顯著性差異;但5-HT3B受體蛋白的表達(dá)量沒有顯著變化(P＞0.05)。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與正常組相比,模型血清組海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca

5、2+濃度明顯降低(P＜0.05),CaM蛋白表達(dá)水平也顯著性降低(P＜0.05);與模型血清組相比,藥物治療血清組海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度較高,CaM蛋白表達(dá)水平亦顯著性升高(P＜0.05),與正常組無明顯差異(P＞0.05)。3.空白組大鼠海馬神經(jīng)元鈣離子平均熒光強(qiáng)度為205.536,添加激動劑孵育15min后,激動劑組神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度和CaM蛋白水平表達(dá)明顯降低(P＜0.01)。事先給予舒郁膠囊和柴胡含藥血清干預(yù)24h

6、后,再次添加激動劑孵育,大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度與空白組相比無明顯變化,較之激動劑組有顯著性升高(P＜0.05),神經(jīng)元胞內(nèi)CaM蛋白表達(dá)變化趨勢與Ca2+一致。結(jié)論:1.抑郁情緒模型大鼠血清處理的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)5-HT3A和5-HT3B受體蛋白表達(dá)量均顯著性升高,證實(shí)該受體與抑郁情緒的密切相關(guān)性。2.Westernblot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,調(diào)肝方藥舒郁膠囊及其君藥柴胡均可以有效糾正模型大鼠海馬神經(jīng)元中5-HT3A受體

7、蛋白表達(dá)異常升高的狀態(tài),從而達(dá)到治療抑郁情緒的目的。3.舒郁膠囊不僅能調(diào)控5-HT3受體蛋白的表達(dá),還可以顯著調(diào)節(jié)5-HT3受體相關(guān)的Ca2+-CaM受體蛋白的含量,其作用方式與5-HT3受體激動劑相反。4.將5-HT3受體信號通路中的Ca2+-CaM體系單獨(dú)研究發(fā)現(xiàn),5-HT3受體激動劑激活信號通路后,使海馬神經(jīng)元內(nèi)大量鈣離子外流,并降低CaM蛋白表達(dá),舒郁膠囊可調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+達(dá)到動態(tài)平衡并增強(qiáng)CaM蛋白表達(dá),推測舒郁膠囊通