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文檔簡介
1、第一部分:
膽酸類成分血藥濃度測定方法的建立
目的:
建立大鼠血清中膽酸類的HPLC-ELSD分析測定方法,為兩種牛黃血清藥物化學(xué)及藥代動力學(xué)研究提供依據(jù)。
方法:
(1)色譜柱:AgelaVenusilMPC18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱,0.2%甲酸水和乙腈為流動相進行梯度洗脫,流速為1.0ml·min-1;蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD);柱溫87.5
2、℃,氮氣流速2.0L·min-1,ImpactOFF進行檢測。(2)血清樣品處理的方法:取血清100μl,加入甲醇900μl,渦旋混勻,12000rpm離心5min;取上清液,0.22μm微孔濾膜過濾;取濾液900μl,37℃水浴氮氣吹干,固體殘留物于-20℃低溫冷凍保存,測定前取出備用。固體殘留物用100μl流動相溶解,渦旋混勻,12000rpm離心5min,取20μl進樣分析。
結(jié)果:
該分析方法的檢測限
3、為1μg·ml-1,定量限為5μg·ml-1。重復(fù)性和穩(wěn)定性考察RSD%值均小于3.91;提取回收率的RSD%值小于3.67。符合生物樣品分析方法的限度要求。
結(jié)論:
本實驗建立了測定大鼠血清中膽酸類含量的HPLC-ELSD法,該方法專屬性強,樣品處理方法簡單、快捷,為藥代動力學(xué)及血清藥物化學(xué)的研究提供了檢測技術(shù)。
第二部分:
天然牛黃與酶促牛黃膽酸類成分的血清中移行成分
4、 目的:
對灌胃給藥天然牛黃與酶促牛黃的大鼠血清進行HPLC-ELSD、HPLC-MS分析,確認二者的入血成分和血中移行成分,從藥效物質(zhì)基礎(chǔ)方面論證酶促牛黃替代天然牛黃的可行性。
方法:
(1)色譜柱:AgelaVenusilMPC18(4.6mm×250mm,5μm)柱;流動相:乙腈(A),0.2%甲酸水(B),梯度洗脫,0min為30%A、70%B,15min為55%A、45%B,30m
5、in90%A、10%B;流速:1.0ml·min-1;柱溫:25℃;檢測器:蒸發(fā)光散射檢測器。ELSD檢測器:漂移管溫度85℃;氮氣流速2.0L·min-1;ImpactOFF。(2)質(zhì)譜條件。離子源:ESI源;檢測方式:負離子檢測;掃描方式:全離子掃描(SCAN);掃描范圍:100-1500amu;毛細管電壓:4.0kV(正、負離子),碎裂電壓:150V;源溫度:99℃;去溶劑氣:N2;干燥氣溫度:350℃;干燥氣流速:9L·min-
6、1;干燥氣壓力:35psig。(3)血清樣品預(yù)處理:取血清100μl,加入甲醇900μl,渦旋混勻,12000rpm離心5min;取上清液,0.22μm微孔濾膜過濾;取濾液900μl,37℃恒溫水浴氮氣吹干,固體殘留物于-80℃低溫冷凍保存,測定前取出備用。固體殘留物用100μl流動相溶解,渦旋混勻,12000rpm離心5min,取20μl進樣分析。
結(jié)果:
Wistar大鼠灌胃天然牛黃、酶促牛黃穩(wěn)態(tài)含藥血清
7、樣品圖譜與空白血清HPLC-ELSD圖譜相比較,確認給藥天然牛黃后血中出現(xiàn)了10個移行成分,其中可以確定的成分為鵝去氧膽酸和去氧膽酸;給藥酶促牛黃后血中出現(xiàn)了7個移行成分,已知成分為鵝去氧膽酸。
結(jié)論:
在天然牛黃灌胃給藥的大鼠血清中發(fā)現(xiàn)10個入血成分,兩個已知入血成分去氧膽酸和鵝去氧膽酸。酶促牛黃灌胃給藥的大鼠血清中發(fā)現(xiàn)7個入血成分,已知入血成分為鵝去氧膽酸。酶促牛黃和天然牛黃發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)存在差異。<
8、br> 第三部分:
牛黃中去氧膽酸與酶促牛黃中鵝去氧膽酸的藥代動力學(xué)研究
目的:
通過所建立的膽酸類成分定量分析方法測定灌胃給藥牛黃后,膽酸類成分在大鼠體內(nèi)的血藥濃度,應(yīng)用3P97軟件計算藥動學(xué)參數(shù),旨在研究牛黃中所含膽酸類成分在動物體內(nèi)的藥物動力學(xué)行為,為牛黃與酶促牛黃開發(fā)提供理論依據(jù)。
方法:
(1)Wistar大鼠40只,隨機分為4組,每組10只。分組灌胃
9、單次給天然牛黃4.0g·kg-1、2.0g·kg-1,酶促牛黃3.8g·kg-1、2.0g·kg-1。給藥后5min、10min、20min、30min、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、9h于尾尖取血約0.5ml。(2)取血清100μl,加入甲醇900μl,渦旋混勻,12000rpm離心5min;取上清液,0.22μm微孔濾膜過濾;取濾液900μl,37℃水浴氮氣吹干,固體殘留物用100μl流動相溶解,渦旋混勻,12000rp
10、m離心5min,取20μl進樣分析,酶促牛黃組測定鵝去氧膽酸含量,天然牛黃組測定去氧膽酸含量。(3)采用3P97藥動學(xué)軟件進行自動擬合處理,以最佳房室模型為標準分別計算每只大鼠的主要藥代動力學(xué)參數(shù)并求出均值,利用統(tǒng)計矩法求算AUC及MRT值,并求算各劑量的絕對生物利用度。
結(jié)果:
(1)大鼠灌胃給天然牛黃后,去氧膽酸T(peak)約為0.72h,T1/2Ka約為0.16h,兩種劑量條件下的分布相半衰期T1/2
11、α約為1.4h,消除半衰期T1/2β約為6h;表觀分布系數(shù)V/F均較小。兩劑量組的去氧膽酸在體內(nèi)的平均滯留時間MRT(0~∞)和MRT(0~t)沒有明顯差異,而AUC(0~∞)和AUC(0~t)差異顯著,AUC與劑量呈正相關(guān)。(2)大鼠灌胃給酶促牛黃后,鵝去氧膽酸T(peak)約為0.78h,T1/2Ka約為0.35h,兩種劑量條件下的分布相半衰期T1/2α約為0.9h、消除半衰期T1/2β約為6h,表觀分布系數(shù)V/F高劑量明顯大于低劑
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