氧化石墨烯對SD大鼠神經(jīng)系統(tǒng)毒性的體內(nèi)外研究.pdf

1、目的:
　　氧化石墨烯（graphene oxide，GO）是石墨烯經(jīng)氧化處理后的衍生物，大小在十納米到幾百納米乃至微米不等，在水中有很好的穩(wěn)定性，表面分布有大量的羥基、環(huán)氧基，邊緣分布有羧基和羰基等含氧活性基團，有較高的熒光猝滅效率以及超強的吸附能力。這些獨特的理化性質(zhì)特別有利于對GO的表面修飾和功能化，以實現(xiàn)對藥物的靶向裝載和緩釋作用等多種功能。因此GO在腫瘤的靶向治療，細胞成像，生物傳感器，生物檢測等方面，顯示了不可估量的應

2、用前景，深受生物醫(yī)學領域的青睞。
　　納米技術在給人類帶來巨大利益的同時，也可能給人類及生態(tài)系統(tǒng)帶來潛在的危險。這些納米級的極小顆粒，容易進入生物體內(nèi)，像小分子一樣在身體各部分間自由穿梭，快速分布于除大腦以外的身體各器官組織中，并與組織、細胞、細胞器和蛋白質(zhì)等生物大分子相互作用，造成組織或細胞的功能異常，影響生物體的健康。也有研究發(fā)現(xiàn)，納米材料還可以穿透血腦屏障。Kreuter等發(fā)現(xiàn)，靜脈注射聚山梨酯-80包裹的阿霉素納米顆粒，可

3、以被大腦毛細血管內(nèi)皮細胞吞噬后穿透大鼠BBB。Oberd(o)rster等也證實，納米材料也可以通過嗅神經(jīng)通路進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)或者經(jīng)感覺神經(jīng)末梢直接轉(zhuǎn)運至腦內(nèi)。進入神經(jīng)系統(tǒng)的納米顆粒，還可以激活小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生ROS，誘發(fā)氧化應激反應、炎癥反應，誘發(fā)神經(jīng)毒性致使神經(jīng)組織損傷。CNS是機體最重要的器官，它整合全身各組織器官的信息，調(diào)控著機體生理活動以及腦的高級活動。所以納米材料對神經(jīng)系統(tǒng)的生物安全性的評價有非常重要的臨床意義，也在很大程度上

4、決定納米材料的應用前景。
　　GO進入體內(nèi)后，能否通過血腦屏障，對神經(jīng)系統(tǒng)有何影響未見相關報道。因此本研究將通過體內(nèi)外實驗綜合評價100～500nm大小的GO對神經(jīng)系統(tǒng)的影響，為GO在多領域的應用提供客觀和科學的實驗依據(jù)。本文從以下兩部分進行了闡述。
　　第一部分:GO對SD大鼠的體內(nèi)神經(jīng)毒性研究。
　　方法:
　　1 GO表征鑒定
　　1.1高分辨透射電子顯微鏡(HRTEM)觀察GO的表面特征。
　

5、　1.2 raman光譜檢測GO表面基團。
　　1.3紫外掃描觀察GO的吸收峰。
　　2動物實驗
　　32只健康清潔級SD雄性大鼠（周齡4～5 w，體重95±10 g），隨機分為對照組（生理鹽水），2.5，5和10mg/kg/d體重3個GO實驗組，8只/組，尾靜脈注射GO到SD大鼠體內(nèi)，1次/d，連續(xù)注射5d，休息2d，以測試動物的檢測指標。連續(xù)注射4周，水迷宮實驗后處死動物。實驗期間分別觀察并記錄:
　　2.1

6、一般情況:檢測動物活動情況、精神狀況，每日食物消耗量及體重變化。
　　2.2尾靜脈給GO前以及第7d、14d、21d、28d，分別測試實驗動物:
　　Open-Field實驗:以觀察實驗動物的神經(jīng)精神活動;
　　功能觀察組合實驗(FOB):綜合評價實驗動物的神經(jīng)主動運動行為、中樞神經(jīng)系統(tǒng)活動、中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性、神經(jīng)肌肉反應、感覺運動功能。
　　2.3實驗第29 d，Morris水迷宮檢測實驗動物的學習記憶以及空

7、間探索功能。
　　2.4水迷宮實驗后，取實驗動物的大腦、小腦、坐骨神經(jīng)及脊髓腰膨大，固定、包埋、切片、染色，光學及透射電子顯微鏡下行組織病理學觀察。
　　結果:
　　1.大鼠一般狀況良好，無死亡和疾病發(fā)生，各劑量組每日食物消耗量、體重變化均無顯著性差異(p＞0.05)。
　　2.Open-Field實驗中:各組實驗動物的水平運動和垂直運動得分均無明顯差異(p＞0.05)。
　　3.FOB綜合實驗中:各組實驗

8、動物的①一般活動及神經(jīng)肌肉測試;②感覺運動及興奮性測試;③自主性活動測試各指標間均無明顯差異(p＞0.05)。
　　4.Morris水迷宮實驗中，大鼠的逃避潛伏期及游泳距離與對照組相比均無顯著性差異(p＞0.05)，在原平臺象限的游泳時間、原平臺象限游程百分比以及穿越平臺次數(shù)均無顯著性差異(p＞0.05)。
　　5.形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn):TEM及光學顯微鏡下，大腦皮層、海馬神經(jīng)元、小腦、坐骨神經(jīng)及脊髓腰膨均未見GO的顆粒存在，也未

9、見明顯的組織病理學改變。
　　結論:
　　中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)中未見GO的顆粒存在，提示GO不能通過血腦及血腦脊液屏障，因此對實驗大鼠的:
　　1.生長發(fā)育、神經(jīng)精神狀況、運動、感覺均沒有明顯影響。
　　2.學習記憶以及空間探索功能沒有明顯影響。
　　3.中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)也未見明顯的組織病理學改變。
　　第二部分:GO對神經(jīng)干細胞和海馬神經(jīng)元的影響。
　　方法:
　　1.GO的鑒定同上。<

10、br>　　2.取SD孕鼠原代培養(yǎng)的二代神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)或培養(yǎng)6～7d的海馬神經(jīng)元接種于6孔或96孔板中，隨機將其分為6組，即對照組（培養(yǎng)液中不加任何刺激因素），10，25，50，100和200μg/mL GO實驗組，分別在培養(yǎng)液中加相應終濃度GO;作用24h或120h。
　　實驗觀察:
　　1.培養(yǎng)期間倒置相差顯微鏡觀察各組細胞的形態(tài)特征。
　　2.培養(yǎng)24h或120h后:

11、r>　　TEM觀察NSCs及海馬神經(jīng)元的超微結構;
　　MTT法檢測NSCs及海馬神經(jīng)元的細胞存活率;
　　臺盼藍排斥實驗檢測細胞死亡率;
　　流式細胞術檢測細胞凋亡及細胞內(nèi)ROS水平;
　　LDH水平檢測評估細胞膜的完整性。
　　結果:
　　1.細胞形態(tài)及超微結構:與對照組相比，GO實驗組NSCs及海馬神經(jīng)元細胞形態(tài)及超微結構均正常。
　　2.細胞存活率:GO作用NSCs及神經(jīng)元24 h或12

12、0 h，GO實驗組細胞的存活率與相應對照組相比均無顯著差異(p＞0.05)。
　　3.細胞死亡率:GO作用NSCs及神經(jīng)元24 h或120 h后，GO實驗組細胞死亡率與相應對照組均無顯著性差異(p＞0.05)。
　　4.細胞膜完整性:GO作用NSCs及神經(jīng)元24 h或120 h，GO實驗組LDH漏出與相應對照組相比均無顯著差異(p＞0.05)。
　　5.細胞凋亡:GO作用NSCs及神經(jīng)元24 h或120 h，GO實驗組

13、細胞的凋亡或死亡與相應對照組相比無顯著差異(p＞0.05)。
　　6.細胞內(nèi)ROS檢測:GO作用NSCs及神經(jīng)元24 h或120 h，GO實驗組細胞內(nèi)ROS水平與相應對照組相比無顯著差異(p＞0.05)。
　　結論:
　　GO直接作用NSCs及海馬神經(jīng)元24h或120h均未引起明顯的細胞毒性效應，其潛在的機制可能是:GO沒有進入NSCs及神經(jīng)元，也沒有誘導細胞的氧化應激反應有關，提示GO與CNS具有良好的生物相容性。<