乳酸桿菌基因工程菌腸粘膜粘附以及對(duì)小分子尿毒素的分解研究.pdf

1、目的:
　　 1.觀察乳酸桿菌基因工程菌在體外對(duì)人結(jié)腸癌類上皮細(xì)胞HT-29細(xì)胞的黏附能力，以及在5/6腎切模型大鼠腸道粘附情況。
　　 2.觀察乳酸桿菌基因工程菌在體外對(duì)小分子尿毒素分解情況，以及對(duì)5/6腎切模型大鼠血清、腸道小分子尿毒素的降解能力。
　　 方法:
　　 1.細(xì)菌粘附實(shí)驗(yàn)①實(shí)驗(yàn)組，為基因工程菌;對(duì)照組，為野生菌。常規(guī)培養(yǎng)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞，分別向HT-29細(xì)胞加入1ml菌液濃度約1.5

2、×108cfu/ml的兩組細(xì)菌共孵，在不同時(shí)間點(diǎn)(0.5h、1h、2h、4h、8h、24h)油鏡下觀察兩組細(xì)菌的黏附情況比較兩者的黏附指數(shù)。②SD大鼠行5/6腎切除術(shù)后分為三組:1）實(shí)驗(yàn)組(n=13)，基因工程菌1.5×108cfu/ml×2ml/d灌胃1次/天。2）對(duì)照組(n=12)，野生菌1.5×108cfu/ml×2ml/d灌胃1次/天。3）病理組(n=10)生理鹽水2ml/天。4周后處死所有大鼠留取三組老鼠胃、空腸、結(jié)腸，刮取各

3、段腸道粘膜，充分勻漿后、涂片，在油鏡下觀察細(xì)菌數(shù)，比較三組細(xì)菌數(shù)的差異。
　　 2.細(xì)菌分解小分子尿毒素實(shí)驗(yàn)①實(shí)驗(yàn)組，為基因工程菌;對(duì)照組，為野生乳酸桿菌（野生菌）;病理組，為無(wú)處理腎衰患者血清。向兩組細(xì)菌中加入腎衰患者血清1ml，在不同時(shí)間點(diǎn)(0.5h、1h、2h、4h、8h、24h)與病理組比較觀察兩種細(xì)菌分解肌酐、尿素氮、尿酸的差異。②SD大鼠行5/6腎切除術(shù)，眼眶靜脈采血后分為三組:1）實(shí)驗(yàn)組(n=13)，基因工程菌15

4、×108cfu/ml×2ml/d灌胃1次/天。2）對(duì)照組(n=12)，野生菌1.5×108cfu/ml×2ml/d灌胃1次/天。3）病理組(n=10)生理鹽水2ml/天。4周后處死大鼠留靜脈血測(cè)肌酐、尿素氮和尿酸值。留取三組大鼠胃、空腸、結(jié)腸內(nèi)容物稀釋、離心后測(cè)肌酐、尿素氮、尿酸值。
　　 結(jié)果:
　　 1.細(xì)菌粘附實(shí)驗(yàn)
　　 1)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在不同時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組基因工程菌對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞

5、的粘附指數(shù)未見(jiàn)不同，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與病理組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠腸道粘附的乳酸桿菌明顯增多(P＜0.05)，其中結(jié)腸粘附的細(xì)菌數(shù)最多。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組胃腸道粘附的乳酸桿菌數(shù)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 2.細(xì)菌分解小分子尿毒素實(shí)驗(yàn)
　　 1)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩組細(xì)菌在0.5h、1h、2h、4h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)小分子尿毒素的降解能力與病理組相比無(wú)差異(P＞0.05

6、)。在8h時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組肌酐下降較快，與病理組相比差異有意義(P＜0.05)。24h時(shí)間點(diǎn)兩組細(xì)菌中的小分子尿毒素有不同程度的降低，實(shí)驗(yàn)組肌酐、尿素氮、尿酸值低于病理組(P＜0.05)，其中肌酐和尿酸值低于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　 2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，灌胃前三組大鼠血清肌酐、尿素氮、尿酸值無(wú)差別(P＞0.05)。灌胃4周后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠血清小分子尿毒素水平降低，病理組大鼠血清小分子尿毒素明顯升高。實(shí)驗(yàn)組與病理組相比

7、肌酐和尿酸值下降具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組血清肌酐、尿素氮、尿酸水平下降幅度分別為36％、7％、30％。實(shí)驗(yàn)組大鼠消化道各段內(nèi)容物小分子毒素水平低于病理組，其中以肌酐和尿酸明顯(P＜0.05)。雖然對(duì)照組中腸道小分子尿毒素低于病理組，但與實(shí)驗(yàn)組相比，肌酐和尿酸水平仍較高(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.乳酸桿菌基因工程菌接受肌酐水解酶和尿酸氧化酶基因重組后，在體外粘附HT-29細(xì)胞與野