骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)內(nèi)溶質(zhì)輸運(yùn)和關(guān)節(jié)軟骨胞內(nèi)鈣響應(yīng)的原位示蹤研究.pdf

1、骨與軟骨是保證身體運(yùn)動(dòng)和提供機(jī)械支撐的主要部分。與其他組織器官相同，骨與軟骨處于一個(gè)動(dòng)態(tài)三維環(huán)境內(nèi)；其內(nèi)部的流體及溶質(zhì)輸運(yùn)對(duì)維持組織本身的功能及自身活性是必不可少的。本研究從骨內(nèi)、骨與軟骨間的物質(zhì)輸運(yùn)和關(guān)節(jié)軟骨胞內(nèi)鈣響應(yīng)三個(gè)方面開展工作，嘗試能更好的理解物質(zhì)輸運(yùn)在骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)內(nèi)的作用。
　　本研究第一部分主要就機(jī)械載荷條件和不同生理病理環(huán)境對(duì)骨的骨陷窩-骨小管系統(tǒng)（LCS）內(nèi)溶質(zhì)輸運(yùn)的影響進(jìn)行量化研究。LCS系統(tǒng)主要由骨細(xì)胞外未鈣化

2、的胞周基質(zhì)（PCM）構(gòu)成。采用本課題組開發(fā)的熒光光漂白恢復(fù)技術(shù)（FRAP）與單軸加載整合加載-成像系統(tǒng)和相應(yīng)數(shù)學(xué)模型，在前期實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證的機(jī)械加載強(qiáng)化微流體環(huán)境的溶質(zhì)對(duì)流的基礎(chǔ)上，本研究就不同機(jī)械載荷條件（強(qiáng)度、頻率）和生理病理?xiàng)l件（彌散性微損傷骨片、基底膜蛋白聚糖缺失基因型小鼠）下骨的LCS系統(tǒng)內(nèi)溶質(zhì)輸運(yùn)的量化研究，進(jìn)而探討LCS微流體環(huán)境內(nèi)溶質(zhì)與胞周基質(zhì)的相互影響。其具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)論如下：
　?、俨捎脽晒鈽?biāo)記小清蛋白（12.

3、3K Da）作為模型蛋白大分子示蹤劑，考察了骨細(xì)胞LCS系統(tǒng)內(nèi)的溶質(zhì)輸運(yùn)與單軸擠壓加載強(qiáng)度（0，2.8或4.8 N）和頻率（0.5，1或2 Hz）的關(guān)系。1）依據(jù)共聚焦顯微采集圖像中骨細(xì)胞熒光強(qiáng)度的變化，計(jì)算了不同加載條件下示蹤分子輸運(yùn)率（k）及輸運(yùn)增強(qiáng)度(對(duì)流輸運(yùn)率/擴(kuò)散輸運(yùn)率，k/k0)。結(jié)果顯示：加載強(qiáng)度增大，溶質(zhì)輸運(yùn)增強(qiáng)度提高，在0-5 N范圍內(nèi)加載強(qiáng)度與輸運(yùn)增強(qiáng)度呈正線性關(guān)系。加載頻率增加，輸運(yùn)增強(qiáng)度呈負(fù)增長(zhǎng)趨勢(shì)。2）結(jié)合前期

4、LCS輸運(yùn)數(shù)學(xué)模擬模型，根據(jù)所測(cè)LCS系統(tǒng)的解剖學(xué)參數(shù)，模擬顯示了溶質(zhì)流速與對(duì)流輸運(yùn)增強(qiáng)度的高度相關(guān)性。依據(jù)對(duì)應(yīng)不同加載強(qiáng)度和頻率產(chǎn)生的對(duì)流輸運(yùn)增強(qiáng)度，計(jì)算了相應(yīng)狀態(tài)下的小清蛋白的溶質(zhì)輸運(yùn)速率。4.8N（0.5 Hz）的間歇式循環(huán)加載產(chǎn)生的平均溶質(zhì)流速為55.8μm/s；當(dāng)加載強(qiáng)度降低至2.8 N，加載產(chǎn)生的平均溶質(zhì)流速減少至43.1μm/s。然而隨著加載頻率依次從0.5、1至2 Hz逐漸增高時(shí)，溶質(zhì)平均流速大幅度降低。3）依據(jù)PCM內(nèi)

5、溶質(zhì)分子的滯后、篩分性，計(jì)算和模擬了溶質(zhì)與基質(zhì)間相互關(guān)系（溶質(zhì)分子反射系數(shù)，Reflection Coefficient）。根據(jù)前期估算所得LCS系統(tǒng)微流體環(huán)境內(nèi)流體流速（58.9μm/s），計(jì)算了相同表面應(yīng)變量下小清蛋白的溶質(zhì)對(duì)流速率為53.9μm/s；通過對(duì)比流體與溶質(zhì)流速的不同，獲得小清蛋白在本研究小鼠骨LCS內(nèi)的反射系數(shù)約為0.084。
　　②針對(duì)彌散性微損傷與線性微裂痕的不同，以熒光素鈉為示蹤分子模擬骨細(xì)胞分泌小分子信號(hào)

6、或流體，研究了基質(zhì)微損傷對(duì)LCS系統(tǒng)在動(dòng)、靜態(tài)條件下溶質(zhì)擴(kuò)散輸運(yùn)的影響。結(jié)果顯示：1）無(wú)外力作用條件下，彌散性微損傷顯著增大了LCS系統(tǒng)內(nèi)的溶質(zhì)擴(kuò)散率。2）在高強(qiáng)度拉伸狀態(tài)下（20，30 N），彌散性微損傷區(qū)骨LCS內(nèi)的溶質(zhì)擴(kuò)散速率顯著提高；但三種拉伸強(qiáng)度（10，20，30 N）間的輸運(yùn)增強(qiáng)度無(wú)顯著差異。
　?、刍诨啄さ鞍拙厶牵≒erlecan/Hspg2，PLN）缺失基因型小鼠的骨組織出現(xiàn)骨小管單位密度下降和骨小管內(nèi)橫斷束帶

7、單位（基質(zhì)纖維）數(shù)量的減少的現(xiàn)象，就PLN缺失小鼠密質(zhì)骨內(nèi)溶質(zhì)自由擴(kuò)散和對(duì)流輸運(yùn)進(jìn)行量化。結(jié)果表明：1）PLN缺失小鼠骨細(xì)胞LCS系統(tǒng)內(nèi)的大分子和小分子的溶質(zhì)擴(kuò)散率均顯著性提高，對(duì)流輸運(yùn)增強(qiáng)度均呈上升趨勢(shì)。2）小清蛋白在對(duì)照小鼠和PLN缺失小鼠的骨細(xì)胞LCS系統(tǒng)內(nèi)的平均流速分別為48.2μm/s和68.4μm/s。小清蛋白在成年P(guān)LN缺失小鼠和正常B6小鼠骨細(xì)胞 PCM內(nèi)的反射系數(shù)分別為0.057和0.039。PLN缺失小鼠骨的PCM篩

8、分性顯著性下降。結(jié)果證實(shí)了PLN缺失改變骨細(xì)胞LCS系統(tǒng)的溶質(zhì)輸運(yùn)。
　　以上結(jié)果說(shuō)明骨組織LCS系統(tǒng)內(nèi)的溶質(zhì)擴(kuò)散和對(duì)流受載荷和生理病理?xiàng)l件的影響。
　　本研究第二部分在前期研究對(duì)軟骨與軟骨下骨的溶質(zhì)輸運(yùn)原位量化的基礎(chǔ)上，就骨關(guān)節(jié)炎（OA）和正常軟骨的解剖學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果顯示：
　?、佘浌窍鹿牵⊿B）和鈣化軟骨（CC）層的平均厚度和總體厚度在老齡化關(guān)節(jié)組中顯著減小；而DMM的OA組的SB層略微增厚，CC層稍有減小，

9、未鈣化軟骨層（AC）和總體厚度無(wú)差異。
　?、趩挝幻娣e上的血管數(shù)量在老齡化和DMM的CC層的分別增加1和0.5倍；相對(duì)于正常小鼠關(guān)節(jié)潮線（TM）通常無(wú)血管存在，老齡化和DMM組TM的平均數(shù)量密度分別高達(dá)51和18＃/mm2。DMM小鼠和老齡化小鼠關(guān)節(jié)的血管和骨髓空間非常接近鈣化軟骨。結(jié)果提示骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)的軟骨與軟骨下骨間的輸運(yùn)特性可能增強(qiáng)。
　　本研究第三部分就不同濃度二甲基前列腺素（PGE2）對(duì)豬關(guān)節(jié)未鈣化軟骨層的三個(gè)不同

10、層（淺層、中層和深層）的軟骨細(xì)胞的胞內(nèi)鈣濃度的影響進(jìn)行考察。研究結(jié)果顯示，低濃度 PGE2（2.5×10-8 mg/ml）明顯刺激培養(yǎng)和原位關(guān)節(jié)軟骨各層軟骨細(xì)胞的胞內(nèi)鈣響應(yīng)；PGE2大幅度正調(diào)節(jié)了淺層的軟骨細(xì)胞胞內(nèi)鈣響應(yīng)，而相對(duì)高濃度PGE2（10-6 mg/ml）顯著性正調(diào)節(jié)中層軟骨胞內(nèi)鈣響應(yīng)。綜合以上檢測(cè)信息可知，低濃度PGE2在軟骨細(xì)胞的信號(hào)輸運(yùn)通路中具有重要作用。
　　總之，本文三個(gè)層次的研究有力地驗(yàn)證了溶質(zhì)輸運(yùn)在骨、軟骨