通絡(luò)干預(yù)提高機(jī)體缺氧自適應(yīng)調(diào)節(jié)能力作用研究.pdf

1、目的：自適應(yīng)是生物體作為復(fù)雜系統(tǒng)在長期進(jìn)化過程中適應(yīng)環(huán)境賴以生存延續(xù)的基本能力。低氧或缺氧不僅是缺血性心、腦血管病等常見病的基本病理過程，同時隨著西部大開發(fā)戰(zhàn)略的實(shí)施更多的內(nèi)陸平原地區(qū)人群進(jìn)入高原地區(qū)，高原低氧導(dǎo)致的急性高原反應(yīng)(AMS)、高原肺水腫等疾病嚴(yán)重危害機(jī)體健康，機(jī)體缺氧自適應(yīng)調(diào)節(jié)能力是提高缺氧耐受性的關(guān)鍵機(jī)制，因此提高機(jī)體缺氧自適應(yīng)調(diào)節(jié)能力研究成為尋找抗缺氧有效干預(yù)策略和藥物的重大課題。本研究在中醫(yī)脈絡(luò)學(xué)說“承制調(diào)平”理論指

2、導(dǎo)下，在既往絡(luò)病理論代表性藥物通心絡(luò)（以下簡稱TXL）治療缺血性心腦血管病取得確切療效基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討對提高機(jī)體缺氧耐受性的影響及相關(guān)機(jī)制：觀察TXL對平原地區(qū)赴藏旅游人群缺氧耐受性的影響；建立急性缺氧兔模型，研究TXL對模型兔缺氧耐受性的影響及其作用機(jī)制；建立急性缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠模型，觀察TXL對進(jìn)一步提高缺氧自適應(yīng)調(diào)節(jié)能力的作用并探討其機(jī)制；研究PI3K/Akt/HIF-1α信號通路在TXL提高人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）缺氧耐受

3、性中的關(guān)鍵作用。
　　 方法：本研究分為以下四部分內(nèi)容
　　 1 通絡(luò)干預(yù)提高平原地區(qū)赴藏旅游人群缺氧耐受性隨機(jī)、雙盲、安慰劑對照研究
　　 以赴藏旅游人群為由平原進(jìn)入高原地區(qū)缺氧人群的代表，采用隨機(jī)、雙盲、安慰劑對照研究，選擇納入復(fù)合標(biāo)準(zhǔn)的志愿者120人按1:1隨機(jī)被分到安慰劑組或TXL組，按隨機(jī)號進(jìn)行分組及藥物發(fā)放，組織進(jìn)行為期10天的赴藏旅游，旅游3天前開始服用藥物，按不同的觀測地點(diǎn)填寫AMS調(diào)查問卷，監(jiān)測

4、脈搏血氧飽和度，進(jìn)行動脈血?dú)夥治?。試?yàn)完成后，將數(shù)據(jù)錄入到臨床試驗(yàn)遠(yuǎn)程數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)并校對，確定數(shù)據(jù)庫后，進(jìn)行首次揭盲，統(tǒng)計(jì)分析得出結(jié)果，再進(jìn)行第二次揭盲。
　　 2 通絡(luò)干預(yù)對急性缺氧兔缺氧耐受性的影響
　　 將24只新西蘭大耳白家兔隨機(jī)分為對照組、缺氧組和TXL組，先在11.4％氧環(huán)境下低氧實(shí)驗(yàn)，分別在缺氧前，缺氧5min，30min，60min時進(jìn)行動脈血?dú)夥治觯?0min后進(jìn)行密閉缺氧，觀察兔密閉缺氧耐受時間，按時

5、間點(diǎn)檢測兔動脈血氧分壓和血氧飽和度，ELISA法檢測血清缺氧誘導(dǎo)因子1-α(HIF-1α)的含量、Western blot法檢測主動脈組織HIF-1α和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的蛋白表達(dá)。
　　 3 通絡(luò)干預(yù)對缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠缺氧耐受性的作用及機(jī)制研究
　　 3.1雄性昆明小鼠隨機(jī)分為缺氧預(yù)適應(yīng)組（對照組）與TXL組，TXL組按1.52g生藥/Kg/d，灌胃給藥，兩組動物分別進(jìn)行0次(H0)、1次(H1)、3次(H3)

6、、5次(H5)重復(fù)缺氧暴露，小鼠置于低氧密閉瓶中，通過小鼠呼吸消耗瓶內(nèi)氧造成瓶內(nèi)低氧，以小鼠出現(xiàn)喘呼吸為低氧耐受極限，然后將小鼠轉(zhuǎn)到另一低氧密閉瓶中，依此類推，連續(xù)進(jìn)行5次低氧。記錄它們的缺氧耐受時間，利用Western blot方法檢測腦組織HIF-1α、VEGF、Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)。
　　 3.240只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為正常對照組、低氧組、低氧預(yù)適應(yīng)組和TXL組(低氧預(yù)適應(yīng)+TXL)，每組10只，利用重復(fù)低氧5次

7、復(fù)制低氧預(yù)適應(yīng)小鼠模型后，進(jìn)行缺氧實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠每次低氧耐受的時間，觀察小鼠大腦皮層神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　 4 PI3K/Akt/HIF-1α信號通路在TXL提高HUVEC缺氧耐受性中的關(guān)鍵作用
　　 4.1將體外培養(yǎng)的HUVEC分為常氧對照組、TXL組、缺氧組、缺氧+TXL（100μg/ml）組共4組。對照組和TXL組細(xì)胞置于常氧條件下：5％CO2+95％空氣；缺氧組、缺氧+通心絡(luò)組細(xì)胞置于低氧條件

8、下：1％O2+5％CO2+94％N2。分別在缺氧12h、24h、48h，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)檢測細(xì)胞的增殖率，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。
　　 4.2將體外培養(yǎng)的HUVEC分為對照質(zhì)粒(GFP)組、DN-HIF組、△p85組、DN-Akt組，每組又分為對照組與TXL組，利用HIF-1α顯性負(fù)性突變體DN-HIF、PI3K顯性負(fù)性突變體△p85、Akt顯性負(fù)性突變體DN-Akt瞬時轉(zhuǎn)染相應(yīng)的HUVEC細(xì)胞后，將細(xì)胞

9、置入1％O2+5％CO2+94％N2的低氧條件下，分別在缺氧12h、24h、48h，利用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞的增殖率和存活率，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。在缺氧4h、12h、24h、36h，
　　 利用Western blot方法檢測HIF-1α蛋白表達(dá)變化及Akt磷酸化水平。
　　 結(jié)果：
　　 1 通絡(luò)干預(yù)提高平原地區(qū)赴藏旅游人群缺氧耐受性隨機(jī)、雙盲、安慰劑對照研究
　　 1.1TXL對赴藏旅游人群

10、AMS發(fā)生率的影響
　　 隨海拔高度的升高，兩組AMS發(fā)生率均逐漸增加，后隨缺氧時間的延長，兩組AMS逐漸降低，表明機(jī)體具有缺氧自適應(yīng)調(diào)節(jié)能力。與對照組比較，TXL組旅游人群在昆侖山口（觀察4）、初到拉薩（觀察6）、日喀則(觀察10)三地AMS發(fā)生率均明顯降低（P＜0.05），其他觀察點(diǎn)TXL有降低趨勢，自西寧至拉薩赴藏旅途中總AMS發(fā)生率明顯低于對照組(P＜0.05)，往返旅游全程中AMS總發(fā)生率亦明顯降低（P＜0.05），表

11、明TXL提高了平原地區(qū)進(jìn)入高原缺氧環(huán)境人群的缺氧耐受性。
　　 1.2TXL對赴藏旅游人群動脈血氧分壓及血氧飽和度的影響
　　 與始發(fā)地石家莊（觀察1）比較，兩組人群在拉薩（觀察6）動脈血氧分壓及血氧飽和度均明顯降低(P＜0.01)，此后隨缺氧時間的延長，與觀察6比較，離開拉薩前一天（觀察14）兩組人群動脈血氧分壓及血氧飽和度均明顯升高（P＜0.01），顯示了機(jī)體具有缺氧自適應(yīng)調(diào)節(jié)能力。在拉薩觀察6和觀察14，TXL組較

12、對照組動脈血氧分壓及血氧飽和度均明顯升高（P＜0.01），表明TXL明顯提高了缺氧環(huán)境中的機(jī)體缺氧耐受能力。
　　 1.3TXL對赴藏旅游人群脈搏血氧飽和度的影響
　　 與低海拔地區(qū)比較，隨海拔高度的升高，兩組人群脈搏血氧飽和度明顯降低(P＜0.01)；隨缺氧時間的延長，對照組與TXL組兩組人群脈搏血氧飽和度明顯升高(P＜0.01)。與對照組比較，TXL組脈搏血氧飽和度明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。
　　

13、 2 通絡(luò)干預(yù)對急性缺氧兔缺氧耐受性的影響
　　 2.1缺氧耐受時間的比較
　　 從密閉缺氧到死亡，缺氧組家兔密閉缺氧耐受時間為（14.33士5.92）min，TXL組缺氧耐受時間為（22.63±4.75）min，在同一缺氧環(huán)境中延長生命達(dá)8min，兩組具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　 2.2血氧分壓和血氧飽和度的變化比較
　　 缺氧前缺氧組與TXL組血氧分壓和血氧飽和度無明顯差異（P＞0.0

14、5）。與缺氧前比較，缺氧組與TXL組兔在濃度為11.4％的低氧環(huán)境5min、30min、60min時，動脈血氧分壓及血氧飽和度均明顯降低（P＜0.01）。與缺氧組比較，TXL組動脈血氧分壓和血氧飽和度降低幅度明顯減?。≒＜0.05或P＜0.01）。而密閉缺氧后，缺氧組與TXL組動脈血氧分壓和血氧飽和度均隨缺氧時間延長而下降，缺氧末（呼吸停止即刻）TXL組兔血氧分壓、血氧飽和度均明顯低于缺氧組（P＜0.01），顯示TXL不僅明顯延長了兔缺

15、氧存活時間，同時在更低血氧濃度時才導(dǎo)致死亡，提高了耐低氧存活能力。
　　 2.3血清HIF-1α的變化比較
　　 HIF-1α為耐缺氧關(guān)鍵蛋白，與缺氧前比較，缺氧組與TXL組血清HIF-1α含量均明顯增加（P＜0.05或P＜0.01），顯示了實(shí)驗(yàn)兔具有缺氧自適應(yīng)調(diào)節(jié)能力；與缺氧組比較，TXL組血清HIF-1α含量增加尤為顯著(P＜0.05或P＜0.01)，表明TXL通過增強(qiáng)HIF-1α蛋白表達(dá)而明顯提高了耐缺氧能力。

16、r>　　 2.4主動脈組織HIF-1α、VEGF的變化比較
　　 與對照組比較，缺氧組和TXL組主動脈組織HIF-1α和VEGF表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01）。而與缺氧組比較，TXL組主動脈組織HIF-1α表達(dá)增強(qiáng)，VEGF表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。
　　 3 通絡(luò)干預(yù)對缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠缺氧耐受性作用機(jī)制研究
　　 3.1兩組小鼠缺氧耐受時間的變化
　　 兩組小鼠分別與第1次缺氧比較，隨著

17、缺氧次數(shù)的增加，缺氧耐受時間均明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）。而與對照組比較，TXL組各次的缺氧耐受時間明顯增加(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 3.2兩組小鼠腦組織HIF-1α、VEGF、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的變化
　　 缺氧前，對照組與TXL組小鼠腦組織有微量HIF-1α、VEGF、Bax表達(dá)，兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），Bcl-2有少量表達(dá)，TXL組表達(dá)高于對照組（P＜0.05）。

18、r>　　 與缺氧前比較，對照組與通心絡(luò)組均隨缺氧次數(shù)增加，HIF-1α、VEGF、Bcl-2表達(dá)逐漸增強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01）；Bax在缺氧1次表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.01)，但在缺氧3次和缺氧5次逐漸降低，較缺氧1次組明顯減少（P＜0.05或P＜0.01）；而與對照組比較，TXL組各次缺氧HIF-1α、VEGF、Bcl-2表達(dá)更加明顯（P＜0.05或P＜0.01），各次缺氧小鼠Bax表達(dá)明顯減弱(P＜0.05或P＜0.01)。

19、
　　 3.3兩組小鼠腦組織HIF-1α表達(dá)（免疫組化）
　　 缺氧前，兩組小鼠大腦皮層神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞無明顯HIF-1α的陽性表達(dá)；隨缺氧次數(shù)的增加，兩組小鼠大腦皮層神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞HIF-1α的陽性表達(dá)逐漸增強(qiáng)；而與對照組比較，TXL組陽性表達(dá)明顯增強(qiáng)。
　　 3.4TXL對缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦皮層神經(jīng)元和內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的作用
　　 與正常對照組比較，缺氧組小鼠腦皮層內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)發(fā)生

20、明顯改變；與缺氧組比較，缺氧預(yù)適應(yīng)組小鼠腦組織神經(jīng)元及血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改善；與缺氧預(yù)適應(yīng)組比較，TXL組腦組織神經(jīng)元及血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)明顯改善。
　　 4 PI3K/Akt/HIF-1α信號通路在TXL提高HUVEC缺氧耐受性中的作用
　　 4.1與正常對照組比較，缺氧組HUVEC增殖率顯著降低；與缺氧組比較，經(jīng)TXL處理后的缺氧+TXL組細(xì)胞增殖率明顯增高。HUVEC缺氧后細(xì)胞凋亡率明顯增高，隨缺氧時間的延長，

21、細(xì)胞凋亡率逐漸增高；與缺氧組比較，經(jīng)TXL干預(yù)的缺氧+TXL組細(xì)胞凋亡率明顯降低。
　　 4.2與缺氧對照組比較，利用DN-HIF抑制HIF-1α的表達(dá)后，缺氧HUVEC的存活率顯著下降，細(xì)胞凋亡率明顯升高，同時TXL提高細(xì)胞存活率和降低細(xì)胞凋亡率的水平明顯受到抑制，表明TXL提高HUVEC耐缺氧存活率和降低凋亡率的作用主要是由HIF-1α介導(dǎo)的。
　　 4.3缺氧條件下，HUVEC細(xì)胞HIF-1α蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，且

22、隨缺氧時間的延長而增加。與對照組比較，應(yīng)用TXL干預(yù)后，HIF-1α蛋白表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)。與對照質(zhì)粒組比較，HUVEC瞬轉(zhuǎn)PI3K的顯性負(fù)性突變體△p85后，HIF-1α蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，同時TXL誘導(dǎo)HIF-1α蛋白表達(dá)水平明顯被抑制。利用Akt的顯性負(fù)性突變體DN-Akt瞬轉(zhuǎn)HUVEC，也得出相同的結(jié)果。表明PI3K/Akt信號途徑介導(dǎo)了HIF-1α蛋白表達(dá)。
　　 4.4缺氧條件下，HUVEC隨著缺氧時間的延長，P-Akt表

23、達(dá)出現(xiàn)明顯變化，在缺氧4h增加，8h增加最明顯，24h有所減少。與對照組比較，經(jīng)TXL干預(yù)后P-Akt表達(dá)明顯增加。與對照質(zhì)粒比較，利用PI3K的顯性負(fù)性突變體△p85瞬時轉(zhuǎn)染后，P-Akt表達(dá)明顯減少；同時TXL誘導(dǎo)P-Akt表達(dá)水平明顯受到抑制。
　　 結(jié)論：
　　 1 通絡(luò)干預(yù)可有效提高平原赴藏旅游人群和實(shí)驗(yàn)動物的缺氧耐受性
　　 本研究以平原赴藏旅游人群、急性缺氧兔、缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠為研究對象，從臨床與基礎(chǔ)

24、研究初步證實(shí)TXL可明顯降低赴藏旅游人群AMS發(fā)生率，提高急性缺氧兔密閉缺氧耐受時間，提高缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠缺氧耐受時間，表明TXL具有提高缺氧耐受性的作用。
　　 2 通絡(luò)干預(yù)通過增強(qiáng)缺氧自適應(yīng)調(diào)節(jié)能力提高缺氧耐受性
　　 自適應(yīng)是生物體作為復(fù)雜系統(tǒng)在長期進(jìn)化過程中形成的適應(yīng)環(huán)境延續(xù)生存的基本能力，實(shí)驗(yàn)動物與平原赴藏旅游人群研究均顯示，隨缺氧時間延長，生命體可產(chǎn)生耐缺氧自適應(yīng)調(diào)節(jié)能力，使缺氧損害明顯降低，赴藏旅游人群隨海拔

25、高度增加AMS發(fā)生率逐漸增高，而隨缺氧時間的延長AMS發(fā)生率逐漸降低，動脈血氧分壓、動脈血氧飽和度、脈搏血氧飽和度明顯升高；缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠隨缺氧次數(shù)的增加，缺氧耐受時間逐漸延長。通絡(luò)干預(yù)可明顯調(diào)動缺氧自適應(yīng)調(diào)節(jié)能力，提高赴藏旅游人群動脈血氧分壓、動脈血氧飽和度、脈搏血氧飽和度，增加缺氧預(yù)適應(yīng)動物缺氧耐受時間，延長實(shí)驗(yàn)動物密閉缺氧到死亡的存活時間，提高了耐低氧存活能力。
　　 3 促進(jìn)HIF-1α蛋白表達(dá)是TXL提高缺氧自適應(yīng)調(diào)節(jié)

26、能力的核心作用機(jī)制，PI3K/Akt/HIF-1α信號通路為其主要途徑
　　 對TXL提高缺氧耐受力及動物耐低氧存活能力的作用機(jī)制的深入研究證實(shí)：TXL可明顯促進(jìn)實(shí)驗(yàn)兔血清、主動脈和缺氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦組織HIF-1α,表達(dá)，離體HUVEC實(shí)驗(yàn)中利用DN-HIF抑制HIF-1α的表達(dá)后，缺氧HUVEC的存活率顯著下降，細(xì)胞凋亡率明顯升高，同時TXL提高細(xì)胞存活率和降低細(xì)胞凋亡率的作用明顯受到抑制，表明TXL提高缺氧耐受力的作用是由H

27、IF-1α介導(dǎo)的。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PI3K/Akt/HIF-1α信號通路為其主要作用途徑。
　　 4 “承制調(diào)平”對揭示缺氧條件下機(jī)體代償性調(diào)節(jié)及治療轉(zhuǎn)歸的內(nèi)在規(guī)律指導(dǎo)臨床防治具有重要理論指導(dǎo)意義
　　 “承制調(diào)平”基于中醫(yī)陰陽五行學(xué)說概括出的脈絡(luò)學(xué)說核心理論，在不同層次上反映了中醫(yī)學(xué)的生理觀、病理觀、治療觀及預(yù)后觀，“承”揭示了人體不斷與自然界進(jìn)行著物質(zhì)交換與信息交流，以維持機(jī)體內(nèi)外環(huán)境的和諧平衡，氧供需平衡的自穩(wěn)調(diào)控

28、機(jī)制即屬“承”的范疇；“制”系指機(jī)體對病理損害的代償性自我調(diào)節(jié)機(jī)制，臨床與實(shí)驗(yàn)研究顯示人體與動物均可在缺氧環(huán)境下提高自適應(yīng)調(diào)節(jié)能力；由“調(diào)”致“平”的通絡(luò)干預(yù)，強(qiáng)調(diào)提高機(jī)體自適應(yīng)調(diào)節(jié)重新恢復(fù)自穩(wěn)平衡態(tài)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)通絡(luò)干預(yù)可明顯促進(jìn)耐缺氧關(guān)鍵蛋白HIF-1α與VEGF以及抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)，抑制促凋亡因子Bax的表達(dá)，重建低氧環(huán)境下機(jī)體耐缺氧損傷的相對平衡態(tài)，其關(guān)鍵機(jī)制為提高機(jī)體缺氧自適應(yīng)調(diào)節(jié)能力，這對缺氧疾病治療具有重要的臨床應(yīng)用