靈芝孢子粉多糖的色譜指紋圖譜研究.pdf

1、靈芝是一種真菌，可食用和藥用，是中醫(yī)藥學(xué)寶庫中的珍品。靈芝由于具有免疫調(diào)節(jié)等多種生理功效，故在近年來備受關(guān)注。因缺乏科學(xué)全面的檢測方法和質(zhì)量標(biāo)準，大量人工栽培生產(chǎn)的靈芝孢子粉、子實體和菌絲體及其加工產(chǎn)品的質(zhì)量良莠不齊，難以有效控制和鑒別。本課題針對靈芝孢子粉的主要免疫活性成分多糖類物質(zhì)，采用多種不同模式的色譜分析技術(shù)嘗試表征孢子粉中多糖的組成和結(jié)構(gòu)特性，從中選擇較優(yōu)方法，對不同產(chǎn)地的靈芝孢子粉樣品中的多糖進行分析和比較，確定共有特征峰，

2、利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”建立靈芝孢子粉多糖的標(biāo)準指紋圖譜，并進行相似度評價。該指紋圖譜方法的建立，可為我國靈芝孢子粉的質(zhì)量檢測方法和質(zhì)量標(biāo)準的提升及完善提供科學(xué)依據(jù)與參考。
　　 為充分提取出靈芝孢子粉樣品中的多糖成分，并盡量避免其多糖的降解和損失，首先對靈芝孢子粉多糖的提取方法進行了較系統(tǒng)的研究。采用超聲輔助提取，微波輔助提取(MAE)和加速溶劑萃取(ASE)三種不同的提取方法提取靈芝孢子粉多糖，分別

3、考察提取溫度、提取時間、料液比等因素對多糖提取率的影響，并結(jié)合采用高效體積排阻色譜法(HPSEC)分析其多糖分子量分布，從多糖提取率和相對分子質(zhì)量分布兩方面，進行比較，從而優(yōu)化提取方法及條件。結(jié)果表明，三種提取方法中對靈芝孢子粉多糖的提取有顯著影響的一個因素是提取溫度，且在不同提取方法的最佳提取條件下，孢子粉多糖的提取率順序為：ASE法(1.5％)＞超聲波法(1.1％)＞MAE(1.0％)，分子量大于10KDa的峰面積占總峰面積的百分比

4、順序為：ASE法(56.6％)＞超聲波法(53.3％)＞微波輔助提取法(51.7％)?？紤]到ASE法的提取成本較高且設(shè)備不夠普及，超聲波法與ASE法的提取效果差異不大，故在本文的色譜指紋圖譜分析中，均選用超聲波法提取靈芝孢子粉多糖。
　　 為使多糖的水解產(chǎn)物較好地反映不同孢子粉樣品中多糖的組成和結(jié)構(gòu)上的差異，考察了不同的酸水解時間和酸濃度對孢子粉多糖的水解產(chǎn)物的分子量分布和不同聚合度糖組分的量的影響，確定了最佳部分酸水解條件，即

5、：沸水浴中用0.5 mol/L的三氟乙酸(TFA)水解60min。
　　 分別采用HPSEC法、部分酸水解-Sugarpak糖柱法及部分酸水解-PMP柱前衍生反相HPLC法，對靈芝孢子粉樣品中多糖進行表征和比較，結(jié)果表明，部分酸水解-pMP柱前衍生RP-HPLC法的分離度和峰形均較好，共有峰較多，指紋信息較豐富，更適合于孢子粉多糖的特性表征和指紋圖譜的構(gòu)建。
　　 在優(yōu)化的條件下提取15個不同產(chǎn)地的靈芝孢子粉樣品中多糖成

6、分，并進行部分酸水解，采用PMP柱前衍生反相高效液相(HPLC)法進行分析比較，確定共有峰14個，峰面積超過總峰面積5％的特征峰有4個，其指紋區(qū)位于17 min至55 min之間；應(yīng)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”軟件建立了靈芝孢子粉多糖的標(biāo)準指紋圖譜，并采用夾角余弦法計算了不同產(chǎn)地樣品的多糖相似度。
　　 方法學(xué)驗證結(jié)果表明，上述指紋圖譜方法穩(wěn)定，精密度高，重現(xiàn)性好，能較簡便地從色譜的整體特征面貌上反映靈芝孢子