靈芝孢子粉多糖的色譜指紋圖譜研究.pdf

1、靈芝是一種真菌，可食用和藥用，是中醫(yī)藥學(xué)寶庫(kù)中的珍品。靈芝由于具有免疫調(diào)節(jié)等多種生理功效，故在近年來(lái)備受關(guān)注。因缺乏科學(xué)全面的檢測(cè)方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，大量人工栽培生產(chǎn)的靈芝孢子粉、子實(shí)體和菌絲體及其加工產(chǎn)品的質(zhì)量良莠不齊，難以有效控制和鑒別。本課題針對(duì)靈芝孢子粉的主要免疫活性成分多糖類(lèi)物質(zhì)，采用多種不同模式的色譜分析技術(shù)嘗試表征孢子粉中多糖的組成和結(jié)構(gòu)特性，從中選擇較優(yōu)方法，對(duì)不同產(chǎn)地的靈芝孢子粉樣品中的多糖進(jìn)行分析和比較，確定共有特征峰，

2、利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”建立靈芝孢子粉多糖的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。該指紋圖譜方法的建立，可為我國(guó)靈芝孢子粉的質(zhì)量檢測(cè)方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升及完善提供科學(xué)依據(jù)與參考。
　　 為充分提取出靈芝孢子粉樣品中的多糖成分，并盡量避免其多糖的降解和損失，首先對(duì)靈芝孢子粉多糖的提取方法進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究。采用超聲輔助提取，微波輔助提取(MAE)和加速溶劑萃取(ASE)三種不同的提取方法提取靈芝孢子粉多糖，分別

3、考察提取溫度、提取時(shí)間、料液比等因素對(duì)多糖提取率的影響，并結(jié)合采用高效體積排阻色譜法(HPSEC)分析其多糖分子量分布，從多糖提取率和相對(duì)分子質(zhì)量分布兩方面，進(jìn)行比較，從而優(yōu)化提取方法及條件。結(jié)果表明，三種提取方法中對(duì)靈芝孢子粉多糖的提取有顯著影響的一個(gè)因素是提取溫度，且在不同提取方法的最佳提取條件下，孢子粉多糖的提取率順序?yàn)椋篈SE法(1.5％)＞超聲波法(1.1％)＞MAE(1.0％)，分子量大于10KDa的峰面積占總峰面積的百分比

4、順序?yàn)椋篈SE法(56.6％)＞超聲波法(53.3％)＞微波輔助提取法(51.7％)。考慮到ASE法的提取成本較高且設(shè)備不夠普及，超聲波法與ASE法的提取效果差異不大，故在本文的色譜指紋圖譜分析中，均選用超聲波法提取靈芝孢子粉多糖。
　　 為使多糖的水解產(chǎn)物較好地反映不同孢子粉樣品中多糖的組成和結(jié)構(gòu)上的差異，考察了不同的酸水解時(shí)間和酸濃度對(duì)孢子粉多糖的水解產(chǎn)物的分子量分布和不同聚合度糖組分的量的影響，確定了最佳部分酸水解條件，即

5、：沸水浴中用0.5 mol/L的三氟乙酸(TFA)水解60min。
　　 分別采用HPSEC法、部分酸水解-Sugarpak糖柱法及部分酸水解-PMP柱前衍生反相HPLC法，對(duì)靈芝孢子粉樣品中多糖進(jìn)行表征和比較，結(jié)果表明，部分酸水解-pMP柱前衍生RP-HPLC法的分離度和峰形均較好，共有峰較多，指紋信息較豐富，更適合于孢子粉多糖的特性表征和指紋圖譜的構(gòu)建。
　　 在優(yōu)化的條件下提取15個(gè)不同產(chǎn)地的靈芝孢子粉樣品中多糖成

6、分，并進(jìn)行部分酸水解，采用PMP柱前衍生反相高效液相(HPLC)法進(jìn)行分析比較，確定共有峰14個(gè)，峰面積超過(guò)總峰面積5％的特征峰有4個(gè)，其指紋區(qū)位于17 min至55 min之間；應(yīng)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”軟件建立了靈芝孢子粉多糖的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，并采用夾角余弦法計(jì)算了不同產(chǎn)地樣品的多糖相似度。
　　 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，上述指紋圖譜方法穩(wěn)定，精密度高，重現(xiàn)性好，能較簡(jiǎn)便地從色譜的整體特征面貌上反映靈芝孢子