靈芝孢子粉對大鼠肝硬化的影響研究.pdf

1、目的及意義: 肝硬化是一種以肝組織彌漫性纖維化、假小葉形成和再生結(jié)節(jié)形成為特征的慢性肝病。臨床上有多系統(tǒng)受累，以肝功能損害和門靜脈高壓為主要表現(xiàn)，晚期常出現(xiàn)消化道出血、肝性腦病、繼發(fā)感染等嚴(yán)重并發(fā)癥。肝硬化是我國常見疾病和主要死亡病因之一，我國肝硬化占內(nèi)科總住院人數(shù)的4．3%-14．2%，發(fā)病高峰在35-48歲，男女比例約為3．6-8：1，嚴(yán)重影響患者健康與生命。 治療上，目前臨床尚無特效藥，平日可用維生素和消化酶，并針

2、對門脈高壓及并發(fā)癥等給予對癥支持處理。近年來對于肝硬化的治療，一些學(xué)者研究制定了防治肝纖維化策略，并且已經(jīng)開始探索從發(fā)病機(jī)制入手的基因調(diào)控與治療，但只是在動物實(shí)驗(yàn)中有進(jìn)展，抗肝纖維化、肝硬化的臨床治療尚未有突破，所以進(jìn)一步探討抗肝纖維化、肝硬化特別是中藥領(lǐng)域有更重要的意義。 在我國，靈芝藥用已有2000多年的歷史，其子實(shí)體、孢子粉、菌絲體均可入藥，現(xiàn)代藥理研究表明，靈芝孢子粉具有許多的藥理作用：抗腫瘤、增加免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)肝臟、抗

3、病毒、對神經(jīng)系統(tǒng)的影響、降血糖、降血脂、鎮(zhèn)痛、抗缺氧能力、抗炎等。另外，靈芝類產(chǎn)品在大量的動物試驗(yàn)中，無論在急性毒性方面、長期攝入引起對機(jī)體的損害方面和致突變及對子代胚胎的發(fā)育方面，均未見有毒性表現(xiàn)的報(bào)道?？梢哉J(rèn)為，靈芝是安全無毒并無潛在致突變性及無對子代產(chǎn)生不良影響的。 本實(shí)驗(yàn)擬初步觀察靈芝孢子粉對大鼠肝硬化的影響，為臨床上預(yù)防和治療肝硬化提供有意義的基本的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考。 實(shí)驗(yàn)材料與方法: 1.主要藥物與儀器

4、: 靈芝孢子粉由東北長白山紅星農(nóng)場提供；四氯化碳、羧甲基纖維素鈉（分析純）等均購自南方醫(yī)科大學(xué)試劑中心；全自動生化分析儀，型號：ECHOLCO，廠家：樂高特。 2.分組與給藥: 實(shí)驗(yàn)中采用完全隨機(jī)化的分組方法，將實(shí)驗(yàn)動物分成4組，即對照組、模型組，靈芝孢子粉低劑量組、靈芝孢子粉高劑量組。對照組及模型組按10ml/kg體質(zhì)量每日灌胃灌胃給予0．9%氯化鈉溶液（NS），靈芝孢子粉低劑量組按10ml/kg體質(zhì)量每日灌胃

5、給予0．05%靈芝孢子粉懸濁液，靈芝孢子粉高劑量組按10ml/kg體質(zhì)量每日灌胃予0．20%靈芝孢子粉懸濁液。 3.模型: 需造模組大鼠灌胃同時按0．3ml/100g體質(zhì)量給予40%四氯化碳菜籽油溶液2周，2周后改為50%四氯化碳菜籽油溶液，應(yīng)用2周，從第5周改為60%四氯化碳菜籽油溶液，應(yīng)用4周，腹腔注射，每周2次。第1、2周給予5%乙醇溶液作為飲用水，第3、4周給予10%乙醇溶液作為飲用水，第5～8周給予20%乙醇溶

6、液作為飲用水（乙醇溶液由上述白酒加蒸餾水配制）。共誘導(dǎo)8周，給予普通顆粒飼料及葵花籽喂養(yǎng)，復(fù)制大鼠肝硬化動物模型；同時通過監(jiān)測體重初步估計(jì)肝功能有無衰竭的可能，以降低造模造成的死亡率。 4.觀察、檢測指標(biāo): 實(shí)驗(yàn)至8周末，禁食、不禁水16小時，10%水合氯醛麻醉，開腹經(jīng)腹主動脈留取動脈血的樣本約5 ml，離心取血清以進(jìn)行血生化等檢測；取臟器（肝臟、脾臟），使用1/10000的電子稱稱量臟器濕重以計(jì)算臟器指數(shù)；將肝臟取材修

7、剪后放入10%福爾馬林中固定，以制作病理切片。 5.統(tǒng)計(jì)方法: 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示，數(shù)據(jù)用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。血液生化學(xué)、臟器濕重和臟器系數(shù)等數(shù)據(jù)，采用One-Way ANOVA；方差齊性時各組之間多重比較采用LSD檢驗(yàn)；方差不齊時采用近似方差分析Welch法，各組之間多重比較采用Dunnett T3檢驗(yàn)。以上檢驗(yàn)以P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果與分析: 1.實(shí)驗(yàn)

8、至8周末，對照組大鼠營養(yǎng)狀況良好，行為、運(yùn)動狀態(tài)未見明顯異常，攝食、攝水及大便未見明顯異常，眼、耳、鼻、口未見異常分泌物，被毛色白，對外界刺激的反應(yīng)正常，逃跑1只大鼠。模型組大鼠腹部膨隆，毛質(zhì)粗糙，消瘦，精神萎靡，動作遲鈍，易激惹，個別大鼠趾甲易出血，有的大鼠頭頸背部、眼眶周圍及前肢出現(xiàn)輕度脫毛，毛色光亮，脫毛處皮膚顏色、質(zhì)地未見異常，死亡5只大鼠，死亡率為25%。靈芝孢子粉低劑量組死亡3只大鼠，死亡率為15%；靈芝孢子粉高劑量組死亡1

9、只大鼠，死亡率為5%。 2.大鼠體質(zhì)量方面，隨著大鼠肝硬化的加重，大鼠體質(zhì)量明顯減輕，四組的大鼠體質(zhì)量之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)=58．678，P<0．001，模型組、靈芝孢子粉低劑量組、靈芝孢子粉高劑量組與對照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均為P<0．001），靈芝孢子粉低劑量組、靈芝孢子粉高劑量組與模型組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0．029，P=0．014）。表明造模導(dǎo)致大鼠體質(zhì)量下降，經(jīng)灌胃給予靈芝孢子粉后大鼠體質(zhì)量下降比模型

10、組少。 3.臟器指數(shù)方面，造模后肝指數(shù)及脾指數(shù)均增大，模型組、靈芝孢子粉低劑量組及靈芝孢子粉高劑量組與對照組相比存在顯著性差異（P值均為P<0．05）；對于肝指數(shù)，靈芝孢子粉低劑量組及靈芝孢子粉高劑量組與模型組比較有顯著性差異（P=0．001，P=0．000）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，經(jīng)灌胃給予靈芝孢子粉后大鼠肝纖維化程度較模型組輕，肝、脾淤血有所減輕。 4.對于反映肝細(xì)胞有無受損及嚴(yán)重程度的指標(biāo)AST及ALT，結(jié)果顯示，經(jīng)四

11、氯化碳菜籽油溶液造模后，大鼠AST、ALT均升高；統(tǒng)計(jì)顯示：模型組、靈芝孢子粉低劑量組及靈芝孢子粉高劑量組與對照組比較有顯著性差異（P值均為P<0．001），靈芝孢子粉低劑量組及靈芝孢子粉高劑量組與模型組比較有顯著性差異（P值均為P<0．05）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，經(jīng)灌胃給予靈芝孢子粉后四氯化碳對大鼠肝細(xì)胞的損害程度較模型組為輕。 5.對于反映肝細(xì)胞蛋白合成代謝功能指標(biāo)，結(jié)果顯示，對于ALB，造模后ALB均降低，模型組、靈芝孢子粉

12、低劑量組及靈芝孢子粉高劑量組均與對照組有顯著性差異（P=0．001，P=0．043，P=0．007），靈芝孢子粉低劑量組及靈芝孢子粉高劑量組的ALB與模型組差異不顯著，但靈芝孢子粉低劑量組及高劑量組的ALB均高于模型組。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，經(jīng)四氯化碳菜籽油溶液復(fù)制大鼠肝硬化模型后，肝臟合成蛋白能力下降，經(jīng)灌胃給予靈芝孢子粉后肝細(xì)胞蛋白合成代謝功能只是逐漸在恢復(fù)。球蛋白增高程度與肝臟疾病嚴(yán)重性相關(guān)，故對于GLB，靈芝孢子粉低劑量組、靈芝孢子

13、粉高劑量組與模型組有顯著性差異（P=0．009，P=0．043）：而對于A/G值，對照組、靈芝孢子粉低劑量組及靈芝孢子粉高劑量組均與模型組有顯著性差異（P=0．000，P=0．000，P=0．003）。 6.對于反映肝臟排泄、分泌及解毒功能的指標(biāo)TBIL，結(jié)果顯示，造模后TBIL均升高，模型組、靈芝孢子粉低劑量組及靈芝孢子粉高劑量組均與對照組有顯著性差異（P=0．001，P=0．026，P=0．004）。 7.組織學(xué)檢查

14、，取肝臟組織，以10%甲醛溶液固定和石蠟包埋制成切片，HE染色，光鏡下觀察可見：（1）模型組大鼠肝小葉正常結(jié)構(gòu)破壞，肝間質(zhì)廣泛纖維組織增生，假小葉形成，即大鼠肝硬化動物模型復(fù)制成功，成模率為70%。同時可見肝細(xì)胞增生反應(yīng)明顯，間質(zhì)內(nèi)彌漫性炎細(xì)胞浸潤。（2）治療組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)因纖維組織分割而紊亂，但纖維組織間隔細(xì)窄，炎細(xì)胞較少，原肝小葉沒有被完全分割，鏡下未見假小葉形成。 根據(jù)以上研究我們可以得出以下初步結(jié)論：（1）在整體水平上