靈芝孢子粉抗腫瘤作用及其質(zhì)量控制的初步研究.pdf

1、目的：研究靈芝孢子粉在體外對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，建立裸鼠移植瘤模型研究靈芝孢子粉在體內(nèi)對(duì)肝腫瘤的抑制作用并初步探討其作用機(jī)制；對(duì)靈芝孢子粉的兩個(gè)有效成分靈芝三萜及靈芝多糖進(jìn)行含量測(cè)定，為進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用靈芝孢子粉提供依據(jù)。 方法：(1)運(yùn)用MTT法研究?jī)煞N靈芝孢子粉在2500μg/ml、1250μg/ml、625μg/ml、312.5μg/ml四個(gè)不同濃度下，對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用；通過流式細(xì)胞術(shù)研究?jī)煞N靈芝孢子粉

2、在3mg/ml、6mg/ml兩個(gè)不同濃度下對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)周期的作用。(2)建立裸鼠皮下移植瘤模型，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)法隨機(jī)分為空白組、陽(yáng)性組及靈芝孢子粉高、中、低劑量組?？瞻捉M腹腔注射生理鹽水，陽(yáng)性組腹腔注射5-氟脲嘧啶，靈芝孢子粉分高、中、低劑量組(分別為2.1g/kg、1.05g/kg、0.5g/kg)灌胃給藥，觀察裸鼠腫瘤生長(zhǎng)情況，給藥21天后處死，取瘤組織稱重，計(jì)算抑瘤率。取高劑量組及空白組做病理觀察，采用蘇木精-伊紅(HE

3、)染色法觀察腫瘤組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)改變。(3)通過免疫組化(SP法)及病理ImageproPlus5.0彩色圖像半定量分析系統(tǒng)檢測(cè)裸鼠腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和微血管密度(MVD)的表達(dá)。(4)以靈芝酸C2為標(biāo)準(zhǔn)品，通過高效液相色譜法對(duì)靈芝孢子粉中靈芝酸C2的含量進(jìn)行測(cè)定。色譜條件為：檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；流動(dòng)相為甲醇∶水=55∶45，各加1％冰醋酸；柱溫40℃；流速0.7ml/min。并通過紫外分光光度法對(duì)靈芝孢子粉中三萜

4、類成分的含量進(jìn)行測(cè)定，含量以靈芝酸C2計(jì)。(5)以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用硫酸-蒽酮比色法，通過紫外-可見分光光度法對(duì)靈芝孢子粉中靈芝多糖的含量進(jìn)行測(cè)定。 結(jié)果：(1)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種靈芝孢子粉對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)均有明顯抑制作用，并且抑制率隨時(shí)間及劑量的增加而升高。濃度為2500μg/ml時(shí)，作用時(shí)間為48h、72h、96h后，兩種靈芝孢子粉對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率分別是29.6％，51.4％，47.2％和30.2％

5、，50.8％，48.4％。兩種靈芝孢子粉對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50值隨作用時(shí)間增加而減小，72h達(dá)到最低，分別為1.93mg/ml和2.14mg/ml。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，靈芝孢子粉3mg/ml時(shí)，對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用主要在G2期，兩個(gè)靈芝孢子粉組HepG2細(xì)胞G2％為1.9％和4.6％，而溶劑對(duì)照組HepG2細(xì)胞G2％為8.0％；靈芝孢子粉6mg/ml時(shí)，可見HepG2細(xì)胞出現(xiàn)凋亡峰。(2)裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)表明，靈芝孢子粉給藥

6、劑量為2.1g/kg(高劑量組)、1.05g/kg(中劑量組)和0.5g/kg(低劑量組)時(shí)，對(duì)裸鼠移植瘤的抑制率分別為58.7％、39.4％和19.5％，其中高劑量組、中劑量組與空白組比較均有顯著差異(P＜0.01)。腫瘤組織切片，HE染色后鏡下觀察，靈芝孢子粉高劑量組與空白組相比，腫瘤壞死區(qū)域較大，細(xì)胞異型性較小。(3)免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)ImageproPlus5.0病理圖像半定量分析系統(tǒng)處理。其中空白組VEGF表達(dá)的灰度值和陽(yáng)性面

7、積比分別為179和0.305，MVD表達(dá)的陽(yáng)性面積比為0.096。靈芝孢子粉高劑量組VEGF表達(dá)的灰度值和陽(yáng)性面積百分比分別為164和0.210，MVD表達(dá)的陽(yáng)性面積比為0.043，靈芝孢子粉組VEGF、MVD的表達(dá)水平較空白組有明顯下降。(4)HPLC法測(cè)得三批靈芝孢子粉中靈芝酸C2含量約為0.129‰，0.108‰和0.094‰，回歸方程Y=17.0919X-22.938，r=0.9999，靈芝酸C2在7.35μg/ml～147μg

8、/ml范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈線性關(guān)系，回收率為95.9％，95.6％和96.4％。紫外分光光度法測(cè)得三批靈芝孢子粉中三萜類成分含量為1.321‰，1.131‰和0.910‰，回歸方程Y=0.0152X-0.0279，r=0.9997，靈芝酸C2在5.6～112μg/ml范圍內(nèi)，濃度與吸光度程良好的線性關(guān)系，回收率為95.8％，95.4％和95.2％。(5)紫外-可見分光光度法測(cè)得三批靈芝孢子粉中靈芝多糖的含量約為1.152％，1.129

9、％和1.007％，回歸方程為Y=0.0091X,r=0.9991，葡萄糖在14.9μg/ml～119.1μg/ml的范圍內(nèi)，濃度和吸光度呈線性關(guān)系，回收率為95.0％，95.1％和95.2％。 結(jié)論：(1)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高劑量的靈芝孢子粉對(duì)HepG2細(xì)胞具有直接的抑制作用，并呈劑量和時(shí)間依賴性。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，靈芝孢子粉可作用于HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的G2期，隨著劑量升高還可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。(2)裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果