GLI3基因與單純性馬蹄內(nèi)翻足的相關性研究及其作用機制探討.pdf

1、前言
　　 單純性馬蹄內(nèi)翻足(Idiopathic congenital talipes equinovarus,ICTEV)是常見的嚴重危害兒童健康的先天畸形之一,發(fā)病率為1～8‰。遺傳因素在ICTEV的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用,遺傳度為65％。但其遺傳方式、外顯率等均不清楚,易感基因尚未確定。目前研究較多的與ICTEV發(fā)病相關的基因主要集中在與足踝部的骨骼、軟骨、肌肉和神經(jīng)發(fā)育相關的基因,如COL9A1,CASP10,WNT7

2、A,HOXD13,GLI3等。本課題組前期應用SNP關聯(lián)分析的方法對84個ICTEV核心家系GLI3基因內(nèi)的2個多態(tài)位點進行分析,提示GLI3基因可能是單純性馬蹄內(nèi)翻足的易感基因。GLI基因家族是一個高度保守的轉錄因子家族,其中的GLI3是極化活性區(qū)內(nèi)的信號分子之一,它可以沿肢體前后軸方向限定各個基因表達的區(qū)域邊界,這為建立肢體不對稱模式提供了必要的位置信息。國內(nèi)外學者對GLI3基因的研究主要集中于它與指(趾)的發(fā)育畸形相關,其突變可以

3、導致多種與指(趾)畸形相關的疾病,但GLI3基因是否與ICTEV的發(fā)病相關還未見報道。另有報道HOXD13基因與ICTEV的發(fā)生密切相關,本實驗進一步探討GLI3基因與ICTEV的相關性,以及在ICTEV發(fā)生過程中HOXD13基因如何調(diào)控GLI3基因的機制。
　　 方法
　　 標本:84例ICTEV患者外周靜脈血和15例ICTEV患者肌肉組織標本由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院小兒外科提供,9例同年齡組的正常人足部肌肉組織及肺

4、組織由中國醫(yī)科大學法醫(yī)學院提供。所有標本使用均經(jīng)患者知情同意。成年Wistar大鼠購自中國醫(yī)科大學實驗動物中心,所有的實驗過程都遵照動物保護條例。
　　 1、變性梯度凝膠電泳技術檢測GLI3基因編碼區(qū)的突變
　　 PCR擴增84例患者GLI3基因10個外顯子(另外4個外顯子基因突變篩查工作前期已經(jīng)完成),應用20％～80％的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳篩查10個外顯子的突變情況。
　　 2、RT-PCR方法研究GLI3

5、基因在ICTEV患者下肢表達情況。
　　 分別提取ICTEV患者及正常人下肢足踝部拇長屈肌、正常人肺組織的總RNA,應用RT-PCR方法檢測GLI3基因的表達。
　　 3、構建ICTEV大鼠模型
　　 Wistar大鼠于孕10天全反式維甲酸灌胃給藥(劑量:135mg/kg體重)。
　　 4、Real Time PCR、免疫組織化學染色和Western Blotting方法研究Gli3基因在ICTEV模型鼠

6、下肢肌肉組織中的表達
　　 分別提取ICTEV模型胎鼠及正常對照胎鼠下肢肌肉組織的總RNA,應用RealTime PCR檢測Gli3基因的表達情況；分別提取ICTEV模型胎鼠及正常對照胎鼠下肢肌肉組織的蛋白質(zhì),應用Western Blotting檢測Gli3蛋白的表達情況；分別取ICTEV模型胎鼠及正常對照胎鼠下肢,甲醛固定,石蠟包埋,按照免疫組化試劑盒操作說明檢測Gli3蛋白表達情況。
　　 5、應用P-Match軟件

7、預測大鼠Gli3基因5'上游序列轉錄因子的結合位點
　　 獲取大鼠Gli3基因上游1100bp 5’側翼序列信息(http://www.ensembl.org),應用P-Match軟件預測其轉錄因子結合位點。
　　 6、熒光素酶報告基因系統(tǒng)
　　 PCR擴增大鼠Gli3基因啟動子區(qū)域依次截短的啟動子序列,構建熒光素酶報告基因表達載體pGL3-Gli3。瞬時轉染大鼠L6細胞,觀察大鼠Gli3基因啟動子區(qū)域活性。

8、r>　　 7、染色質(zhì)免疫沉淀實驗(ChIP)
　　 將孕14天胎鼠下肢肢芽直接勻漿處理,甲醛交聯(lián)、酶切后應用Gli3抗體進行沉淀,沉淀下來DNA通過PCR擴增檢測結果。
　　 8、凝膠遷移實驗(EMSA)
　　 孕14天胎鼠下肢肢芽組織核蛋白和3’生物素標記的探針(含有位點2)在凝膠阻滯緩沖液中室溫結合1小時,10％聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉膜、紫外交聯(lián)后,應用化學發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測結果。
　　 9、RNAi

9、使Hoxd13基因表達下調(diào),觀察Gli3基因的表達情況
　　 化學合成Hoxd13基因的siRNA,轉染大鼠L6細胞后,通過Real Time PCR的方法觀察Gli3基因表達水平的改變。
　　 10、在大鼠L6細胞系中外源表達Hoxd13后觀察Gli3基因表達
　　 構建Hoxd13的真核細胞表達載體PIRES2-EGFP-Hoxd13,瞬時轉染大鼠L6細胞后,通過Real Time PCR的方法觀察Gli3基

10、因表達水平的改變。
　　 結果
　　 1、在84例ICTEV患者外周靜脈血中未發(fā)現(xiàn)GLI3基因外顯子1～8、外顯子13存在突變。
　　 2、在ICTEV患者及正常人下肢拇長屈肌中都未檢測到GLI3基因的表達。
　　 3、不論在mRNA水平,還是在蛋白質(zhì)水平,Gli3基因在ICTEV模型胎鼠下肢組織中的表達都要明顯高于正常對照胎鼠。
　　 4、大鼠Gli3基因5’側翼序列啟動子區(qū)域存在不同的調(diào)控因子

11、,利用P-Match軟件預測后發(fā)現(xiàn)2個Hoxd13的可能結合位點,分別命名為Hoxd13結合位點1(-667～-663)和Hoxd13結合位點2(-477～-473)。
　　 5、在大鼠胚胎肢體發(fā)育過程中Hoxd13可以和Gli3基因啟動子區(qū)Hoxd13結合位點2直接結合。
　　 應用染色質(zhì)免疫沉淀技術驗證在體內(nèi)Hoxd13和Gli3基因上游序列的結合作用。以孕14天的大鼠胎鼠下肢肢芽組織為研究材料進行了染色質(zhì)免疫沉淀實

12、驗,實驗證實反膠聯(lián)后提取的DNA上僅有Hoxd13結合位點2的擴增,無Hoxd13結合位點1的擴增。實驗結果表明在大鼠胚胎肢體發(fā)育過程中Hoxd13蛋白可以和Gli3啟動子區(qū)的Hoxd13結合位點2結合發(fā)揮其轉錄調(diào)節(jié)作用。
　　 6、在體外Hoxd13蛋白可以和Gli3基因啟動子區(qū)位點2直接結合。
　　 EMSA結果表明,當Hoxd13蛋白質(zhì)存在時出現(xiàn)阻滯的DNA-蛋白質(zhì)復合體,當加入Hoxd13抗體時出現(xiàn)超阻滯條帶。證

13、明在體外Hoxd13和預測的Hoxd13結合位點2可以直接結合。
　　 7、RNAi方法干擾HoxD13基因表達后,Gli3基因表達情況。
　　 將吉瑪公司設計的三個Hoxd13基因的siRNA瞬時轉染大鼠L6細胞系中,發(fā)現(xiàn)其中一個siRNA能使Hoxd13表達下調(diào),同時檢測到該標本中Gli3基因表達明顯上調(diào),說明Hoxd13很可能是Gli3基因的負調(diào)控因子。
　　 8、大鼠L6細胞系中外源過量表達Hoxd13后

14、Gli3基因的表達情況。
　　 將Hoxd13的真核細胞表達載體PIRES2-EGFP-Hoxd13瞬時轉染大鼠L6細胞后,通過Real Time PCR的方法觀察到Hoxd13基因的表達水平明顯上調(diào),同時Gli3基因表達水平下調(diào)。
　　 結論
　　 1、GLI3基因的編碼區(qū)突變可能不是ICTEV發(fā)病的因為。
　　 2、HOXD13基因的表達下調(diào)并導致GLI3基因的表達上調(diào)可能與ICTEV畸形的發(fā)生有關。