三角褐指藻AA和EPA合成的△5脂肪酸去飽和酶研究.pdf

1、多不飽和脂肪酸(PUFA)指含有兩個或兩個以上雙鍵且碳鏈長為16-22個碳原子的直鏈脂肪酸,如EPA(eicosapentaenoic acid,20:5)和DHA(docosapentaenoic acid,22:6),他們對人類健康非常重要,比如:減輕炎癥,調(diào)節(jié)血壓,降低膽固醇的含量,調(diào)控脂類代謝,預(yù)防和治療動脈粥樣硬化和心血管疾病,調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能,調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能,還可以開發(fā)為抗腫瘤藥物。目前,EPA和DHA主要來源于深海

2、魚油,但是隨著市場需求的迅速增長和海洋可捕撈魚類資源的日益減少,深海魚油已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要,因此,尋找更為持續(xù)、穩(wěn)定的LCPUFAs來源成為當(dāng)務(wù)之急。海洋微藻是EPA_和DHA的初級生產(chǎn)者,從微藻中提取PUFA的生產(chǎn)工藝比魚油簡單,而且產(chǎn)品沒有魚腥味,膽固醇含量低。但是海洋微藻多為自養(yǎng)藻,生長緩慢,細(xì)胞得率低,培養(yǎng)過程中容易染菌,所以,大規(guī)模從微藻中提取生產(chǎn)EPA和DHA來滿足社會需求還不能實現(xiàn)。
　　 PUFAs生物合成始于

3、LA和ALA,該生物合成過程中涉及到一系列脂肪酸去飽和酶(FAD)和脂肪酸延伸酶(FAE)。FAD脫氫反應(yīng)的機(jī)制是將脂肪酸鏈中C-C轉(zhuǎn)化為C=C,每個FAD都在?；湹奶囟ㄎ恢靡腚p鍵。近年來,對海洋微藻PUFAs合成相關(guān)酶基因的研究進(jìn)展非常快,已經(jīng)從多個藻種中克隆了參與EPA和DHA合成所涉及的去飽和酶基因和延伸酶基因,并且實現(xiàn)了基因的異體表達(dá),這為實現(xiàn)得到高產(chǎn)的PUFAs,解決EPA／DHA資源問題,降低生產(chǎn)成本,提供了一條新的途徑

4、。D5的功能驗證具有重要的生化應(yīng)用意義,該基因能夠被用在富含PUFA的轉(zhuǎn)基因油料作物上,具有重要的醫(yī)療和保健作用。加深對PUFA合成過程中基因調(diào)解機(jī)制的了解將會影響單細(xì)胞油脂的產(chǎn)量,比如,改善微藻的生長條件,可以將強(qiáng)EPA／DHA的產(chǎn)量,進(jìn)而可以影響依靠微藻的養(yǎng)魚業(yè)的發(fā)展。此外,FAD和FAE在食品工程,植物基因工程以及發(fā)酵工程等領(lǐng)域的廣闊應(yīng)用前景是毋庸置疑的,另外,二者在上述領(lǐng)域的應(yīng)用將加深促進(jìn)人們對脂肪酸合成途徑的認(rèn)識和研究。

5、>　　 本論文實驗材料三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)為自養(yǎng)藻,EPA含量豐富,可達(dá)總脂肪酸的30％以上,還含有少量的DHA,是研究脂肪酸合成途徑中相關(guān)去飽和酶的非常好的實驗材料。本文的工作內(nèi)容和研究成果如下:
　　 1.以三角褐指藻為研究材料,實驗室培養(yǎng),通過對其培養(yǎng)基中氮營養(yǎng)鹽限制脅迫不同時間(12h、24h、48h、72h、96h),研究了不同時間的氮營養(yǎng)鹽脅迫對三角褐指藻生長生理及其脂肪

6、酸組成的影響。試驗結(jié)果表明,在試驗設(shè)置的氮營養(yǎng)脅迫時間范圍內(nèi),與對照相比,三角褐指藻的生長沒有明顯的變化；隨著氮脅迫時間的延長,葉綠素a,類胡蘿卜素以及葉綠素的含量明顯下降；EPA的含量占總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)比也隨氮脅迫時間的延長而減小。
　　 2.△5脂肪酸去飽和酶(△5 fatty acid desaturase)是合成花生烯酸(AA)和EPA的關(guān)鍵酶。為了構(gòu)建三角褐指藻△5脂肪酸去飽和酶基因(簡稱D5)的原核表達(dá)重組質(zhì)粒,并實

7、現(xiàn)在E.coli BL21(DE3)中的表達(dá)。本研究根據(jù)GenBank中三角褐指藻D5序列,設(shè)計引物,擴(kuò)增該基因并插入到pET28a中,測序鑒定后,轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物。結(jié)果表明pET28a-D5構(gòu)建成功,IPTG能誘導(dǎo)D5特異性表達(dá)。上述實驗結(jié)果為真核生物膜蛋白的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 3.本實驗將三角褐指藻D5分離并將其轉(zhuǎn)入酵母中進(jìn)行表達(dá),結(jié)果顯示,重組