虹鱒、花鱸和大黃魚Δ6脂肪酸去飽和酶調(diào)控差異的研究.pdf

1、以虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、花鱸（Lateolabrax japonicus）和大黃魚（Larimichthys cr ocea）分別代表淡水、廣鹽性和海水肉食性魚類，研究三種不同適鹽性類型的肉食性魚受植物油影響的差異，以及體內(nèi)△6脂肪酸去飽和酶調(diào)控差異。
　　本文主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.飼料中植物油替代魚油對虹鱒、花鱸和大黃魚幼魚生長、脂肪酸組成、脂肪沉積和組織結(jié)構(gòu)的影響
　　以初始體

2、重分別為（11.24±0.07 g）、（18.60±0.36 g）和（8.93±0.21 g）的虹鱒、花鱸和大黃魚幼魚為研究對象，通過70d的攝食生長實(shí)驗(yàn)，研究植物油（亞麻籽油∶豆油=1∶1）分別替代0％（FO，對照組）、50％(FV)和100％(VO)的魚油對不同適鹽性魚類生長性能、脂肪酸組成、脂肪沉積和組織結(jié)構(gòu)的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，植物油替代50％和100％的魚油后不影響虹鱒的攝食、生長、飼料效率和成活率，花鱸和大黃魚的

3、上述指標(biāo)隨植物油替代水平的升高而顯著降低。三種魚的肝指數(shù)不受飼料處理的顯著影響，但內(nèi)臟指數(shù)隨著植物油替代魚油水平的升高而增加，且花鱸和大黃魚的肝臟脂肪含量隨植物油替代魚油水平的升高而顯著升高。隨著植物油替代魚油水平的升高，三種魚肌肉中的n-3 LC-PUFA的含量逐漸降低，但在虹鱒中，魚油組和50％植物油替代組中n-3 LC-PUFA的含量無顯著差異，而在肝組織中50％植物油替代組和植物油組沒有顯著差異，均顯著低于魚油組。隨著替代水平升

4、高，虹鱒、花鱸和大黃魚的肝細(xì)胞中脂肪滴累積程度逐漸增高，相同替代水平下大黃魚肝細(xì)胞中脂肪滴累積程度最為嚴(yán)重;腸道組織中杯狀細(xì)胞隨植物油替代水平升高而增多，而在大黃魚全植物油組出現(xiàn)脂肪滴累積和上皮細(xì)胞死亡現(xiàn)象。
　　2.虹鱒、花鱸和大黃魚△6FAD的基因啟動子克隆和生物信息學(xué)分析
　　利用基因步移方法，克隆到虹鱒、花鱸和大黃魚的△6FAD啟動子序列，長度分別為:1479 bp、2064 bp和996 bp。Blast比對顯示三

5、種魚的△6FAD啟動子序列與已提交NCBI的魚類△6FAD序列具有較高的保守性。多序列比對顯示，三種魚與大西洋鮭和歐洲鱸魚含有相同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)NF-Y和SRE，但在虹鱒、鱸魚和大黃魚△6FAD啟動子中均未發(fā)現(xiàn)大西洋鮭所具有SP1結(jié)合位點(diǎn)。
　　3.虹鱒、花鱸和大黃魚轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1和PPAR-α的cDNA全長克隆以及生物信息學(xué)分析
　　分別克隆得到虹鱒、花鱸和大黃魚的SREBP-1基因cDNA全長，其長度分別為4

6、220 bp、3797 bp和3750 bp。通過BLAST分析發(fā)現(xiàn)，虹鱒、花鱸和大黃魚的SREBP-1序列與已知魚類的SREBP-1具有較高的同源性，通過與人類SREBP-1的N端進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，魚類的SREBP-1與人類的SREBP-1a的相似度大于人類的SREBP-1c。SREBP-1的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果與傳統(tǒng)的分類學(xué)結(jié)果一致。
　　PPAR-α基因在虹鱒和花鱸中有兩個亞型，而在大黃魚中只存在一個。通過BLASTP分析和多序列

7、比對，發(fā)現(xiàn)PPAR-α1和PPAR-α2均與哺乳類具有較高同源性，具有相同的DNA-binding domain和ligand-binding domain結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建PPAR-α的系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，該進(jìn)化樹明顯地分為兩支，擁有兩種PPAR-α基因的魚類，如花鱸、斑馬魚等，其兩個基因分別在進(jìn)化樹的不同分枝上。這說明在魚類進(jìn)化過程中，PPAR-α基因在部分魚類中發(fā)生了基因重復(fù)，可能基因亞型的功能也因此發(fā)生了分化。
　　4.飼料中植物

8、油替代魚油對虹鱒、花鱸和大黃魚△6FAD、SREBP-1和PPAR-α的mRNA表達(dá)的影響。
　　隨著植物油替代魚油水平的升高，虹鱒、花鱸和大黃魚△6FAD、SREBP-1和PPAR-α在肝臟中的mRNA表達(dá)逐漸升高，但在肌肉、脂肪和腸道組織中存在不同的結(jié)果。這可能是因?yàn)轸~體的不同組織對植物油響應(yīng)的程度以及脂肪酸的合成能力存在差異。植物油替代魚油后也促進(jìn)了三種魚組織中SREBP-1的表達(dá)量，但在虹鱒的脂肪和腸道中，以及花鱸的肝臟和

9、肌肉中出現(xiàn)了SREBP-1基因的mRNA表達(dá)量隨著替代水平升高先降低再升高的趨勢。在虹鱒和大黃魚肝臟中，植物油替代魚油導(dǎo)致PPAR-α基因表達(dá)量升高，但是在花鱸的肝臟和肌肉中，卻出現(xiàn)了植物油抑制PPAR-α基因表達(dá)的現(xiàn)象，所以PPAR-α基因?qū)χ参镉偷捻憫?yīng)在不同魚類中具有不同的效果。在花鱸腸道組織和大黃魚的肝臟和肌肉組織中，△6FAD分別與SREBP-1和PPAR-α的表達(dá)量存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。
　　5.虹鱒、花鱸和大黃魚中轉(zhuǎn)錄

10、因子SREBP-1和PPAR-α基因?qū)Α?FAD的調(diào)控作用
　　在以上研究的基礎(chǔ)上，將三種魚的轉(zhuǎn)錄因子開放閱讀框分別連入載體PCS2+，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒;將三種魚的△6FAD基因啟動子序列分別連入PGL3-Basic質(zhì)粒中，構(gòu)建報告質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒PCS2-和PGL3-共轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中，通過檢測雙熒光素酶活性的比值來探討轉(zhuǎn)錄因子對△6FAD啟動子的調(diào)控活性的強(qiáng)弱。啟動子活性比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，虹鱒△6FAD啟動子的活性顯著高于花

11、鱸和大黃魚。在三種魚中轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1對△6FAD啟動子都具有激活作用，但是激活程度具有差異，在虹鱒和大黃魚中激活程度約1.6倍，在花鱸中高達(dá)4.6倍。在三種魚類中，轉(zhuǎn)錄因子PPAR-α對△6FAD啟動子的具有不同的激活活性:在虹鱒中，只有PPAR-α2基因?qū)Α?FAD啟動子具有1.3倍的激活作用;在花鱸中PPAR-α1和-α2對△6FAD啟動子都具有激活作用，但激活的程度不高;在大黃魚中PPAR-α對△6FAD啟動子沒有顯著的激

12、活作用。
　　為進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1和PPAR-α對△6FAD的調(diào)控作用，虹鱒中開展了RNA干擾實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，虹鱒中轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1和PPAR-α2的siRNA都成功干擾了相應(yīng)基因的表達(dá)，并分別在干擾后4h和6h表達(dá)量達(dá)到最低。伴隨著轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量降低，△6FAD的表達(dá)也出現(xiàn)降低，并在轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1和PPAR-α2表達(dá)量下降到最低點(diǎn)后的2h和6h達(dá)到表達(dá)最低水平。以上結(jié)果再次證明，虹鱒中SREBP-