高不飽和脂肪酸對(duì)離體大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞營養(yǎng)生理及免疫力的影響.pdf

1、本研究借助離體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),研究高不飽和脂肪酸在魚類免疫應(yīng)答中的作用,回答有關(guān)高不飽和脂肪酸對(duì)魚類免疫調(diào)控的部分機(jī)制問題。主要研究內(nèi)容包括:(1)大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞體外模型的建立。(2)花生四烯酸(ARA,20:4n-6)對(duì)離體大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞營養(yǎng)生理及免疫力的影響。(3)二十碳五烯酸(EPA,20:5n-3)和二十二碳六烯酸(DHA,22:6n-3)對(duì)離體大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞營養(yǎng)生理及免疫力的影響。主要研究結(jié)果如下:
　　 (

2、1)通過優(yōu)化Pereoll密度梯度離心技術(shù),從大黃魚頭腎組織中分離純化巨噬細(xì)胞,并優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件。對(duì)所分離細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析、普通光鏡和電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察以及細(xì)胞功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:相比34％/51％Pereoll梯度分離液,31％/45％梯度的Pereoll分離液分離巨噬細(xì)胞效率更高。經(jīng)瑞氏-吉姆薩染色分析,初分細(xì)胞中巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞的比例高達(dá)42％,過夜培養(yǎng)后使細(xì)胞貼壁,沖洗掉未貼壁細(xì)胞,在所形成的細(xì)胞單層中,巨噬細(xì)胞/單

3、核細(xì)胞的純度可達(dá)到90％以上。細(xì)胞單層分別置于18℃、22℃以及26℃無CO2恒溫培養(yǎng)箱中,于添加5％FBS的L15培養(yǎng)基中培養(yǎng)120h,MTT細(xì)胞活力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)22℃條件下培養(yǎng)的細(xì)胞活力顯著高于其他溫度條件。普通光鏡和電鏡觀察到大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞具有偽足發(fā)生和較強(qiáng)的吞噬能力、胞漿中富含線粒體以及吞噬小泡。當(dāng)施加LPS刺激后,細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性隨LPS濃度以及孵育時(shí)間變化而變化。孵育3h后,LPS協(xié)同PMA可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞超氧陰離子(O2-)

4、的產(chǎn)生。然而,孵育24h后,LPS協(xié)同PMA顯著抑制細(xì)胞O2-的生成(P＜0.05)。添加LPS復(fù)合PMA或人類腫瘤壞死因子a(hrTNF-a)或者鈣離子載體A23187無法有效刺激大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞產(chǎn)生較多的一氧化氮(NO)。
　　 (2)將不同濃度ARA(5μM、25μM、50μM、100μM、200μM和1000μM)以脂肪酸-胎牛血清白蛋白(FA-BSA)的形式添加到培養(yǎng)基中,孵育12h、24h和36h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,細(xì)

5、胞活力隨著ARA濃度的升高以及孵育時(shí)間的延長而下降,尤其在孵育36h后,高濃度的ARA(200μM和1000μM)同對(duì)照組相比顯著降低了細(xì)胞活力(P＜0.01),同時(shí)高濃度的ARA(200μM和1000μM)可以顯著誘導(dǎo)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化物的生成(P＜0.05)。細(xì)胞吞噬能力隨ARA濃度的升高呈先上升后降低的趨勢(shì),其中25μM和100μM的ARA顯著促進(jìn)了細(xì)胞吞噬能力,而1000μM的ARA則顯著抑制細(xì)胞吞噬能力(P＜0.01)。100μM

6、的ARA可以顯著提高大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞的O2-生成量(P＜0.05)。ARA能顯著提高分泌型磷脂酶A2(sPLA2)的生成量(P＜0.01),但是其濃度的增加并不隨ARA濃度的改變而變化。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中前列腺素E2(PGE2)濃度隨ARA濃度的增加而顯著增加(P＜0.01),最大值出現(xiàn)在1000μMARA處理組中。然而,ARA濃度對(duì)白細(xì)胞介素1β(IL-1β)的生成量卻無顯著影響,且處理組培養(yǎng)液中IL-1β的濃度都處于一個(gè)較低的水平(

7、約6pg/ml左右)。
　　 (3)分別將不同濃度EPA或DHA(5μM、25μM、50μM、100μM、200μM和1000μM)以FA-BSA的形式添加到培養(yǎng)基中,孵育一定時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,細(xì)胞活力隨著EPA或DHA濃度的增大以及孵育時(shí)間的延長而下降,分別孵育24h和36h后,細(xì)胞活力隨脂肪酸濃度升高明顯下降。其中,200μM和1000μM的EPA或DHA處理組細(xì)胞活力均顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。高濃度的DHA(20

8、0μM和1000μM)可以誘導(dǎo)細(xì)胞生成脂質(zhì)過氧化物(P＜0.01)。然而,所有EPA處理組中脂質(zhì)過氧化物的生成量均與對(duì)照組無顯著差異。巨噬細(xì)胞的吞噬能力隨EPA或DHA濃度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì),5μM的DHA顯著提高細(xì)胞的吞噬能力(P＜0.05),而高濃度的EPA或DHA(200μM和1000μM)顯著抑制了其吞噬能力(P＜0.01)。EPA可以顯著提高大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞O2-生成量(P＜0.05),而DHA則顯著抑制了O2-生成

9、量(P＜0.05)。EPA或DHA顯著抑制了大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞sPLA2的生成量(P＜0.01),并且與EPA相比,DHA的抑制作用更明顯。1000μM的EPA或DHA顯著地促進(jìn)了細(xì)胞PGE2的生成量(P＜0.01),其他EPA或DHA濃度均抑制巨噬細(xì)胞PGE2的生成量。EPA或DHA對(duì)IL-1β的生成量卻無顯著影響,且培養(yǎng)液中IL-1β的濃度都處于一個(gè)較低的水平(約6pg/ml左右)。
　　 本研究首次利用大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞體