Omega-3多不飽和脂肪酸對(duì)人肝細(xì)胞和巨噬細(xì)胞抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 危重新生兒、早產(chǎn)兒、先天性消化道畸形、嚴(yán)重消化道疾病以及消化道手術(shù)的患兒不能通過(guò)胃腸道獲得足夠營(yíng)養(yǎng)時(shí)，需要用靜脈營(yíng)養(yǎng)液由靜脈途徑提供各種營(yíng)養(yǎng)素，稱為靜脈營(yíng)養(yǎng)，又名完全胃腸外營(yíng)養(yǎng)(totalparenteralnutrition，TPN)。靜脈營(yíng)養(yǎng)，已被兒科界尤其是新生兒界普遍公認(rèn)為是一種相對(duì)安全、有效的治療措施，能及時(shí)為患兒提供必要的能量、營(yíng)養(yǎng)，維持患兒的生命，為進(jìn)一步治療贏得時(shí)間。但是，隨著TPN在兒科

2、領(lǐng)域臨床應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，其并發(fā)癥也日見(jiàn)增多，尤其是長(zhǎng)期應(yīng)用的患兒更容易發(fā)生。早在1971年，PedenV.H就報(bào)道了胃腸外營(yíng)養(yǎng)相關(guān)肝損害(parentalnutritionassociatedliverdisease，PNALD)，并指出PNALD是TPN常見(jiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥，甚至可威脅患兒生命;并且隨著TPN應(yīng)用時(shí)間的延長(zhǎng)，其發(fā)生率也相應(yīng)增高。尤其對(duì)于那些生理機(jī)能尚未發(fā)育成熟的新生兒和嬰幼兒，在長(zhǎng)期接受TPN治療時(shí)，更容易發(fā)生PNALD。

3、1998年，Kelly的研究報(bào)道顯示，長(zhǎng)期接受TPN治療的患兒中，大約有40％-60％的患兒會(huì)發(fā)展成不同程度的肝功能紊亂。同年，Sondheimer等做了一項(xiàng)臨床研究，在42名接受六周短期TPN治療的患兒中，約有13％的患兒發(fā)展成為肝功能衰竭。PNALD在成人和嬰幼兒中的病理基礎(chǔ)是不同的，成人以肝脂肪變性為主，而嬰幼兒則以膽汁淤積最為常見(jiàn)。進(jìn)展型PNALD可以導(dǎo)致肝臟損害，肝衰竭，甚至多臟器功能衰竭，一旦發(fā)生PNALD，不僅需要中斷TP

4、N的治療，還會(huì)對(duì)原發(fā)病產(chǎn)生不良影響，嚴(yán)重者甚至危及生命。因此，PNALD的預(yù)防與治療顯得尤為重要。
　　 目前，PNALD發(fā)病的確切機(jī)制尚不清楚，但TPN相關(guān)膽汁淤積(TPN-associatedcholcstasis，PNAC)是其主要的病理基礎(chǔ)。PNAC的發(fā)生普遍認(rèn)為是多因素共同作用的結(jié)果，諸如早產(chǎn)兒肝臟功能不成熟、早期禁食、胃腸外營(yíng)養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分失衡以及某些成分具有肝毒性、胎齡以及早期感染（如敗血癥、導(dǎo)管相關(guān)性感染、壞死性

5、小腸結(jié)腸炎）及腸道手術(shù)等基礎(chǔ)疾病。第一、PNAC與早產(chǎn)兒及新生兒尚未發(fā)育成熟的膽汁排泄系統(tǒng)和肝臟功能密切相關(guān)，首先，發(fā)育不成熟的膽管系統(tǒng)使得肝臟的攝取率降低，膽汁酸再循環(huán)障礙;其次，由于早產(chǎn)兒的肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)和膽酸代謝功能均不完善，肝臟攝取、合成膽鹽的能力降低導(dǎo)致膽紅素的肝腸循環(huán)障礙;再次，由于膽汁在腸道內(nèi)停留時(shí)間延長(zhǎng)，在腸道細(xì)菌作用下的石膽酸形成（毒性膽鹽）增多，并重吸收到肝臟，對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。第二，接受TPN治療的患兒由于不能耐受經(jīng)

6、口喂養(yǎng)，或喂養(yǎng)不足，喂養(yǎng)延遲，缺乏有效的胃腸道刺激，使一些胃腸激素，如胃動(dòng)素、胃泌素、促胰液素、胰高血糖素、舒血管腸肽等減少，膽囊收縮力下降，導(dǎo)致膽汁淤積。有研究表明，早期腸內(nèi)喂養(yǎng)的平均攝入量與膽汁淤積的發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)。第三，不恰當(dāng)?shù)腡PN及營(yíng)養(yǎng)成分失衡，首先，例如:高熱卡，靜脈營(yíng)養(yǎng)液的熱卡過(guò)高使肝臟內(nèi)水分、糖原和脂肪沉積增加，從而引起肝細(xì)胞腫脹，膽管堵塞，最終導(dǎo)致膽汁淤積。有研究顯示，隨著攝入熱卡的降低，PNAC的發(fā)生率明顯下降;其次

7、，必需氨基酸的缺乏，輸入氨基酸的量和成分亦與PNAC的發(fā)生有關(guān)。TPN溶液的肝毒性可能與酪氨酸、半胱氨酸、?；撬岬缺匦璋被崛狈τ嘘P(guān)。牛磺酸對(duì)早產(chǎn)兒是一種重要的氨基酸，它與多種肝酶的活性有關(guān)，可促進(jìn)膽汁流動(dòng)和防止石膽酸的毒性，缺乏?；撬峥梢鹉懼俜e。第四，感染，接受靜脈營(yíng)養(yǎng)的患兒發(fā)生感染后隨之出現(xiàn)了膽汁淤積，原因可能為細(xì)菌等病原微生物感染后導(dǎo)致肝酶異常，膽汁分泌減少，致病微生物產(chǎn)生的內(nèi)毒素抑制了肝細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶的活性，肝

8、膽管的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)受到破壞、功能失調(diào)，從而抑制了肝細(xì)胞對(duì)膽汁酸的攝取及轉(zhuǎn)運(yùn)。內(nèi)毒素的刺激，使肝臟發(fā)生了一系列炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，首先，肝臟Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生肝毒性的細(xì)胞因子TNF-α、IL-1和IL-6;其次，腸道也作出了相應(yīng)反應(yīng)，即正向調(diào)節(jié)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1和IL-6的產(chǎn)生，加重了肝臟的損傷。小腸蠕動(dòng)的減慢和腸內(nèi)細(xì)菌過(guò)度滋生，內(nèi)毒素產(chǎn)生增加，而內(nèi)毒素可以直接損害肝細(xì)胞，減少膽汁的合成及分泌，加重膽汁淤積的程度。反之，膽汁淤積導(dǎo)致胃

9、腸道感染，嚴(yán)重感染促進(jìn)胃腸道膿毒癥的發(fā)生，隨之而來(lái)的是全身系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生了大量細(xì)胞因子，直接抑制了肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和酶的活性，進(jìn)而又促進(jìn)肝臟的纖維化，加重了原有的膽汁淤積，這樣就形成了感染和膽汁淤積之間的惡性循環(huán)，進(jìn)一步導(dǎo)致嚴(yán)重的PNALD。近年來(lái)，研究最多的是靜脈營(yíng)養(yǎng)乳化脂類在PNALD的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中所起的重要作用。臨床上應(yīng)用的脂肪乳劑主要成分為脂肪酸和甘油三酯，其中的脂肪酸有多種，根據(jù)脂肪酸分子結(jié)構(gòu)中碳鏈的長(zhǎng)度可分為短鏈脂肪

10、酸(2C-4C)、中鏈脂肪酸(6C-12C)和長(zhǎng)鏈脂肪酸(14C-24C)。由于人體不能合成亞油酸、亞麻酸和二十碳四烯酸，這三種脂肪酸必須從外界攝取，因此稱之為必需脂肪酸，其它脂肪酸稱為非必需脂肪酸;脂肪酸碳鏈中的碳原子間有的完全以共價(jià)鍵結(jié)合，稱為飽和脂肪酸，有的則含有不飽和雙鍵，稱為不飽和脂肪酸，含有一個(gè)不飽和雙鍵的稱為單不飽和脂肪酸，含有多個(gè)不飽和雙鍵的稱為多不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids，PUFA

11、s)。從碳鏈的甲基端開(kāi)始，如第一個(gè)不飽和雙鍵位于第三個(gè)碳原子上，則稱為omega-3多不飽和脂肪酸，同樣還有omega-6、omega-7和omega-9多不飽和脂肪酸。長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸中的omega-3PUFAs和omega-6PUFAs代謝后可產(chǎn)生花生四烯酸類物質(zhì)，但omega-3PUFAs和omega-6PUFAs的代謝產(chǎn)物有所不同，前者代謝生成的產(chǎn)物為三烯酸環(huán)氧化物和五烯酸脂氧化物，后者代謝生成的是二烯酸環(huán)氧化物和四烯酸脂氧化

12、物。Omega-6PUFAs的代謝產(chǎn)物具有強(qiáng)烈的促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用，包括收縮血管和平滑肌，提高毛細(xì)血管通透性，促進(jìn)血小板聚集，白細(xì)胞趨化作用和免疫抑制;而omega-3PUFAs代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)雖然與omega-6PUFAs代謝產(chǎn)物類似，具有相似的生理功能，但其生理作用僅為omega-6PUFAs的1/100左右，為減輕omega-6PUFAs代謝產(chǎn)物對(duì)機(jī)體免疫功能和炎癥反應(yīng)的不利影響，可以在omega-6PUFAs當(dāng)中添加適量的om

13、ega-3PUPAs，可以降低毛細(xì)血管通透性，減輕水腫，抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)，減輕或避免脂肪乳劑導(dǎo)致的免疫抑制，改善免疫功能。二十碳五烯酸(Eicosapentaenoicacid，EPA)是一種omega-3多不飽和脂肪酸，是十八碳亞麻酸的分解產(chǎn)物，最初從魚(yú)油和母乳中發(fā)現(xiàn)，它存在于細(xì)胞膜磷脂脂肪酸結(jié)構(gòu)中。有研究表明，EPA可以改變細(xì)胞磷脂膜的成分，影響細(xì)胞膜流動(dòng)性和膜上相關(guān)信號(hào)分子、酶及受體的功能，從而改變信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，來(lái)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。

14、Omega-3多不飽和脂肪酸的抗炎作用還表現(xiàn)在它能夠減少前列腺素(prostaglandins)的合成，進(jìn)而降低炎性因子的釋放，最終實(shí)現(xiàn)減少炎癥反應(yīng)，減輕肝臟受損的程度。雖然，臨床相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)，在靜脈營(yíng)養(yǎng)液中添加適量omega-3多不飽和脂肪酸，對(duì)長(zhǎng)期接受TPN治療的患兒有明顯的保護(hù)作用，但對(duì)于omega-3多不飽和脂肪酸確切的作用機(jī)制還不清楚。
　　 機(jī)體促炎和抗炎平衡的變化，反映了PNALD的狀態(tài)及進(jìn)展情況。在PNALD

15、的發(fā)病過(guò)程中，促炎反應(yīng)主要是通過(guò)巨噬細(xì)胞和肝臟中的Kupffer細(xì)胞介導(dǎo)的，它們是通過(guò)釋放炎性因子來(lái)實(shí)現(xiàn)的，最具有代表性的是腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6（IL-6）。血漿TNF-α和IL-6的水平與肝臟受損的嚴(yán)重程度正相關(guān)。如果損傷持續(xù)存在，就會(huì)產(chǎn)生大量的TNF-α和IL-6，炎癥的持續(xù)存在最終會(huì)導(dǎo)致肝硬化和瘢痕組織的形成;另一方面，抗炎因子白介素-10(IL-10)，在調(diào)節(jié)過(guò)度炎癥反應(yīng)方面有重要的作用，有助于降低機(jī)體炎癥

16、反應(yīng)的程度。
　　 我們假設(shè)omega-3多不飽和脂肪酸可以作用于相關(guān)細(xì)胞，從而影響細(xì)胞促炎和抗炎因子的產(chǎn)生。本研究通過(guò)培養(yǎng)正常人外周血巨噬細(xì)胞和正常人肝細(xì)胞，觀察在模擬外源性（LPS介導(dǎo)）和內(nèi)源性(PGE2介導(dǎo))炎癥模型中，促炎因子TNF-α和IL-6分泌水平的改變，同時(shí)應(yīng)用omega-3和omega-6多不飽和脂肪酸進(jìn)行干預(yù)，證實(shí)omega-3多不飽和脂肪酸在抗炎反應(yīng)中的重要作用。在omega-3多不飽和脂肪酸干預(yù)的巨噬細(xì)胞

17、和LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中，觀察到促炎因子TNF-α、IL-6分泌水平的改變，從而進(jìn)一步證實(shí)了omega-3多不飽和脂肪酸不僅對(duì)巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞有直接的抗炎作用，而且還可以通過(guò)激活的巨噬細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞發(fā)揮間接的保護(hù)作用。
　　 研究方法：
　　 1、細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
　　 (1)人外周血單核細(xì)胞(Peripheralbloodmononuclearcells)的分離與培養(yǎng)
　　 健康人新鮮全血（購(gòu)

18、自香港紅十字會(huì)輸血處）通過(guò)FicollPaque梯度分離法中分離出單核細(xì)胞。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將ACKbufferandFicoll加入新鮮全血中，室溫下靜置15分鐘，用PBS緩沖液稀釋后，2000rpm離心25分鐘。細(xì)胞分層，將中間層細(xì)胞（主要是淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和血小板）轉(zhuǎn)移到新的離心管中，室溫1200rpm離心7分鐘，小心去掉上清液。為了除去血小板，用PBS緩沖液混懸沉淀，800rpm離心7分鐘，棄掉上清并重復(fù)此過(guò)程兩次。然后，加入35m

19、lRPMI1640培養(yǎng)液充分混勻，1200rpm離心7分鐘。去上清，用50ml巨噬細(xì)胞SFM培養(yǎng)液充分混勻后，加入6-well細(xì)胞培養(yǎng)板(2mL/well)，放置于培養(yǎng)箱中(37℃，5％CO2)7天后，單核細(xì)胞演變成巨噬細(xì)胞，備用。
　　 (2)正常人肝細(xì)胞系(THLE-3)的準(zhǔn)備
　　 正常人肝細(xì)胞系(THLE-3)，購(gòu)自AmericanTypeCultureCollection(ATCC，USA)培養(yǎng)在預(yù)先用纖維蛋白

20、處理過(guò)的培養(yǎng)板中。按要求在專用的BEGM培養(yǎng)液中加入牛膠原蛋白-1(0.03mg/ml)，牛血清白蛋白(0.01mg/ml)，培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37℃，5％CO2)，每2-3天換一次培養(yǎng)液，備用。
　　 2、具體實(shí)驗(yàn)方案
　　 (1)LPS、PGE2誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞炎性因子TNF-α、IL-6的表達(dá)。在人巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞的培養(yǎng)液中分別加入LPS(0.1μg/ml)、PGE2(0.1μg/ml)，繼續(xù)孵育8h、1

21、6h、24h、32h分別收集各時(shí)間點(diǎn)的上清液。用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)方法，精確檢測(cè)TNF-α和IL-6的含量。
　　 (2)預(yù)先用EPA、從及EPA+AA干預(yù)巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞，再給予LPS、PGE2刺激細(xì)胞，觀察TNF-α和IL-6的表達(dá)。
　　 在巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入100μMEPA、100μMAA、100μMEPA+AA的混合物（比例為1∶1）培養(yǎng)24h后，用PBS洗兩次，再加入LPS(0.1μg/

22、ml)、PGE2(0.1μg/ml)模擬體內(nèi)外的炎癥刺激，孵育24h后，收集上清液。用ELISA方法，精確檢測(cè)TNF-α和IL-6含量。
　　 (3)同時(shí)給予巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞刺激和保護(hù)，觀察TNF-α和IL-6表達(dá)的變化。
　　 在巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞的培養(yǎng)液中同時(shí)加入誘導(dǎo)炎癥發(fā)生LPS(0.1μg/ml)、PGE2(0.1μg/ml)以及干預(yù)試劑100μMEPA、100μMAA、100μMAAEPA+AA（比例為1∶1），

23、共同培養(yǎng)24h后，收集上清液。用ELISA方法，精確檢測(cè)TNF-α和IL-6的含量。
　　 (4)先用LPS、PGE2誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞，再給予EPA、從及EPA+從進(jìn)行干預(yù)，觀察TNF-α和IL-6的表達(dá)。
　　 在巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞的培養(yǎng)液中分別加入LPS(0.1μg/ml)、PGE2(0.1μg/ml)培養(yǎng)24h后，用PBS洗兩次，再向培養(yǎng)液中分別加入l00μMEPA、100μMAA、100μMEPA+從（比例為1

24、∶1）孵育24h后，收集上清液。用ELISA方法，精確檢測(cè)TNF-α和IL-6的含量。
　　 (5)用LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞，再給予EPA干預(yù)后，觀察TNF-α、IL-6和IL-10在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)。
　　 在巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入LPS(0.1μg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，用PBS洗兩次，再向培養(yǎng)液中加入100μMEPA，繼續(xù)孵育8h、16h、24h、32h后，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別收集上清液。用ELISA方法，精確檢測(cè)TN

25、F-α、IL-6和IL-10含量，觀察其變化。
　　 (6)聯(lián)合培養(yǎng)LPS誘導(dǎo)后經(jīng)EPA干預(yù)的巨噬細(xì)胞和LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞，觀察促炎因子TNF-α和IL-6表達(dá)的變化。
　　 首先，在巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入LPS(0.1μg/ml)培養(yǎng)24h后，用PBS洗兩次，再加入100μMEPA;其次，在肝細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入LPS(0.1μg/ml)培養(yǎng)24h;然后，將以上處理過(guò)的兩種細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)24h后，收集上清液。用ELISA方

26、法，精確檢測(cè)TNF-α和IL-6的含量，觀察其變化。
　　 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 所有統(tǒng)計(jì)資料均采用(x)±SD描述，統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用方差分析(ANOVA)和Student'st-test檢驗(yàn)。P＜0.05（*）認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果
　　 1、LPS對(duì)巨噬細(xì)胞的刺激比PGE2的刺激更敏感。在0.1μg/mlLPS和0.1μg/mlPGE2的刺激下，巨噬細(xì)胞均產(chǎn)生大量的TNF-α和IL-6，甚

27、至比未經(jīng)處理的巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-6高出10倍以上，且在24h時(shí)，達(dá)到峰值，以后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，變化趨于平坦。相同的刺激作用于肝細(xì)胞，也可以觀察到類似的結(jié)果，但其反應(yīng)程度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于巨噬細(xì)胞。用LPS和PGE2誘導(dǎo)細(xì)胞，模擬體內(nèi)體外的炎性刺激，成功的誘導(dǎo)出細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，但不同的細(xì)胞對(duì)不同的炎癥刺激的反應(yīng)程度是不同的。我們觀察到，在24h時(shí)，反應(yīng)最為顯著。因此，在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，我們以24h作為研究的時(shí)間點(diǎn)。
　　 2

28、、在致炎因素刺激之前，對(duì)巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞均分別給予100μMEPA、100μMAA、100μMEPA+從（比例為1∶1）三種方式干預(yù)24h，再用0.1μg/mlLPS和0.1μg/mlPGE2刺激24h，檢測(cè)TNF-α，IL-6的水平。發(fā)現(xiàn)相對(duì)于未干預(yù)組，EPA干預(yù)組TNF-α，IL-6的表達(dá)水平明顯下降(p＜0.05)。AA組和EPA+AA的混合物組也觀察到了TNF-α、IL-6不同程度的下降，但其下降幅度遠(yuǎn)不如單獨(dú)EPA干預(yù)組(p＜

29、0.05)。
　　 3、當(dāng)同時(shí)給予巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞刺激因素0.1μg/mlLPS、0.1μg/mlPGE2以及三種不同的干預(yù)方式進(jìn)行保護(hù)時(shí)，我們可以清楚的觀察到，雖然在各個(gè)干預(yù)組中TNF-α和IL-6的表達(dá)都有所下降，但只有EPA干預(yù)組變化最為顯著。比較兩種不同時(shí)間的干預(yù)（先給予干預(yù)還是同時(shí)給予刺激和干預(yù)），可以得出:先給予干預(yù)的效果要好于后者。
　　 4、先給予致炎因素刺激24h后，再分別給予三種不同的干預(yù)方式進(jìn)行處理

30、。我們驚喜的發(fā)現(xiàn)，先刺激后干預(yù)的處理方式，可以最大程度的降低炎性因子的釋放。另外，在三種不同的干預(yù)方式中，EPA干預(yù)組的效果最好，與其他兩種干預(yù)方式相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　 5、既然，EPA能有效地抑制促炎因子的產(chǎn)生;接下來(lái)使我們好奇的是，它是否能改變抗炎因子IL-10的生成呢？在這里，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)了，用LPS刺激24h后的巨噬細(xì)胞，給予100μMEPA進(jìn)行干預(yù)，在不同的時(shí)間點(diǎn)8h、16h、24h、32h

31、測(cè)出IL-10的分泌水平有著顯著的提高，并且在24h時(shí)，其值達(dá)到了頂點(diǎn)(280.32±11.86pg/ml)。更為有趣的是，在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，促炎因子TNF-α和IL-6則恰好降到了最低水平。
　　 6、前面的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示我們，EPA可以顯著降低被LPS刺激后的巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的水平，同時(shí)提高了IL-10的分泌水平。因此我們會(huì)提出疑問(wèn):這種作用是否可以間接的通過(guò)巨噬細(xì)胞作用于肝細(xì)胞呢？于是，我們聯(lián)合培養(yǎng)被L

32、PS刺激后，又用EPA處理過(guò)的巨噬細(xì)胞和用LPS刺激的肝細(xì)胞。結(jié)果顯示:與未處理組相比，促炎因子TNF-α和IL-6分別降低了85.2％和75.9％。
　　 研究結(jié)論：
　　 1、用LPS和PGE2模擬體外體內(nèi)炎癥，成功的刺激了正常人巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞分泌出大量的促炎因子TNF-α和IL-6，但不同的細(xì)胞對(duì)不同的刺激因素反應(yīng)程度是不同的。
　　 2、EPA、從以及EPA+AA（比例為1∶1）的混合物都有抑制細(xì)胞炎癥

33、反應(yīng)的作用，但其中以單獨(dú)用EPA的效果最好。
　　 3、不同的干預(yù)時(shí)機(jī)，其治療效果是不同的。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中我們可以看到:在先于，同時(shí)和后于刺激因素給予三種不同的干預(yù)方式中，先刺激后干預(yù)的效果最為顯著。
　　 4、用EPA處理過(guò)的細(xì)胞，不僅促炎因子TNF-α和IL-6的水平顯著降低了，同時(shí)，抗炎因子IL-10的水平也顯著提高了。有趣的是，這兩種作用均在24h時(shí)，達(dá)到了峰值。
　　 5、通過(guò)聯(lián)合培養(yǎng)EPA處理過(guò)且被LP

34、S刺激的巨噬細(xì)胞和LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞，檢測(cè)其促炎因子TNF-α和IL-6水平的變化，我們得出:EPA不僅對(duì)巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞有直接的抗炎作用，而且，可以通過(guò)活化的巨噬細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞發(fā)揮間接的抗炎作用。
　　 創(chuàng)新及意義：
　　 1、本研究首次成功培養(yǎng)原代人類外周血單核細(xì)胞（演變?yōu)榫奘杉?xì)胞）來(lái)比較研究omega-3多不飽和脂肪酸在不同治療階段的作用。此外，我們模擬活體內(nèi)肝臟的真實(shí)情況:聚集了大量的肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞來(lái)設(shè)

35、計(jì)實(shí)驗(yàn)，因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加有說(shuō)服力。
　　 2、本研究闡述了omega-3多不飽和脂肪酸(EPA)在100μM的濃度下，有效地抑制了被LPS和PGE2刺激的巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞促炎因子的產(chǎn)生，并且其作用要明顯好于omega-6多不飽和脂肪酸（AA）及它們的混合物。這些發(fā)現(xiàn)幫助我們回答在臨床TPN營(yíng)養(yǎng)液的配制是單獨(dú)添加omega-3多不飽和脂肪酸，還是以混合物的方式添加的問(wèn)題。
　　 3、本研究首次通過(guò)聯(lián)合培養(yǎng)omega-3多