N-乙酰半胱氨酸防治糖尿病性白內(nèi)障的動(dòng)物和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過觀察N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）滴眼液對(duì)鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的糖尿病性白內(nèi)障大鼠的晶狀體混濁程度進(jìn)展的影響以及NAC對(duì)高糖（high glucose，HG）誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的作用，來探討NAC 對(duì)糖尿病性白內(nèi)障的作用及其機(jī)制。 方法： (1) 對(duì)85 只大鼠行裂隙燈檢查，排除晶狀體病變。隨機(jī)抽取10 只大鼠作為正常對(duì)照組，其余大鼠接受1

2、％STZ（65mg/kg）枸櫞酸緩沖液（20mmol/L，pH4.5）腹腔注射，72h后血糖值＞14mmol/L 的大鼠作為糖尿病大鼠。治療組大鼠分別給予NAC（0.01％和0.05％）磷酸鈉緩沖液（25mmol/L，pH7.4）滴眼，3 次/d；其余組相應(yīng)給予磷酸鈉緩沖液（25mmol/L,pH7.4）滴眼，3次/d。 (2) 通過裂隙燈觀察并記錄大鼠晶狀體混濁的進(jìn)展。晶狀體混濁分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)采用英國牛津大學(xué)眼科實(shí)驗(yàn)室方法。分別于4

3、w，8w 和13w 時(shí)分批處死大鼠，取出晶狀體，測定其中水溶性蛋白質(zhì)、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation endoproducts，AGEs)的含量以及谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性。并監(jiān)測大鼠血糖、尿糖和體重的變化。 (3) 用終濃度120mM 的HG 誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞(human l

4、ensepithelium cells，hLEC)凋亡,處理組:DMEM+NAC+HG；對(duì)照組:DMEM+HG。用TUNEL 法觀察細(xì)胞凋亡情況，并用分光光度法檢測Caspase-3 酶的活性。 結(jié)果: (1) 約79％(59/75) 的大鼠對(duì)STZ（65mg/kg）腹腔注射起反應(yīng)（血糖＞14mmol/L）。1mo 后糖尿病模型大鼠中，3 只大鼠因血糖降低至14mmol/L以下，予以剔除。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，糖尿病大鼠血糖

5、顯著高于正常對(duì)照組大鼠（P<0.05），糖尿病大鼠體重顯著低于正常對(duì)照組大鼠（P<0.05）。 (2) 糖尿病未治療組大鼠STZ 注射后第3w 晶狀體開始出現(xiàn)混濁，其混濁表現(xiàn)為兩階段進(jìn)展，前6w 緩慢進(jìn)展及后7w 快速進(jìn)展。兩個(gè)濃度的NAC治療組大鼠STZ 注射后第4w 晶狀體開始出現(xiàn)混濁，第4w 時(shí)，0.01％NAC治療組比糖尿病未治療組大鼠的晶狀體混濁程度明顯減輕（P＝0.023，P<0.05）；0.05％NAC 治療組較糖

6、尿病未治療組大鼠的晶狀體混濁程度也略有減輕（P>0.05）；而0.01％NAC 和0.05％NAC 治療組之間的大鼠的晶狀體混濁程度并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。 (3) 在實(shí)驗(yàn)早期（4w，8w）糖尿病未治療組大鼠晶狀體中GSH 含量及CAT，GR 活性與正常對(duì)照組相比均有降低；在第13w，三者下降更為顯著，分別的降低了約50％（P<0.05），20％（P<0.05），及50％（P<0.05）。而糖尿病未治療組大鼠晶狀體中糖

7、基化終產(chǎn)物含量與正常對(duì)照組相比出現(xiàn)增加,在實(shí)驗(yàn)后期（13w），糖尿病組的糖基化終產(chǎn)物含量比正常組增高46.1％（P<0.05）。兩濃度的NAC 治療組晶狀體GSH 含量及CAT 活性的下降與糖尿病組相比差別均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是在治療的早期（4w），0.01％NAC治療組與0.05％NAC 治療組較糖尿病未治療組的晶狀體GSH 含量分別增高了10.0％（P>0.05）與20.4％（P>0.05）；CAT 活性分別增高10.6％（P>0.

8、05）與13.3％（P>0.05）。而兩個(gè)NAC 治療組與未治療組之間的GR 活性以及AGEs的含量在實(shí)驗(yàn)各個(gè)階段并沒有明顯的差別（P>0.05)。盡管兩個(gè)NAC 治療組的各個(gè)指標(biāo)變化相對(duì)未治療組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是其GSH 含量及CAT 活性在實(shí)驗(yàn)各個(gè)階段仍然有明顯的增加趨勢。 (4) 120 mM 的HG 作用24 h 后可引起晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，處理組在HG 誘導(dǎo)前就加入NAC，48 h 時(shí)NAC 處理組的hLEC 凋亡率

9、較未處理組有降低，72 h 時(shí)NAC 處理組的hLEC 凋亡率為(34.14±1.98)％明顯低于未處理組的(46.37±2.08)％（P<0.05）。TUNEL 染色陽性細(xì)胞核固縮或碎裂呈棕黃色，細(xì)胞大小不一，散在分布或呈小片狀分布。NAC 處理組的Caspase-3 酶活性在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均比非處理組低，在48 h 和72 h，NAC 處理組的Caspase-3 酶活性比對(duì)照組分別低30.1％（P<0.05）和39.0％（P<0.05）

10、。 結(jié)論： (1) NAC 滴眼液對(duì)早期糖尿病性大鼠晶狀體混濁程度具有輕度的抑制作用，其作用機(jī)制可能與NAC 作為GSH 的前體物質(zhì)補(bǔ)充了晶狀體的GSH 含量有關(guān)。 (2) NAC 可有效抑制HG 引起的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，其抑制作用可能與降低Caspase-3 酶活性有關(guān)。 (3) NAC 可以通過抑制晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，補(bǔ)充晶狀體GSH 含量，抑制氧化損傷，從而達(dá)到抑制糖尿病性白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展的作用。