谷胱甘肽乙酯和肌肽延緩糖尿病性白內(nèi)障的動(dòng)物和細(xì)胞生物學(xué)研究.pdf

1、目的：1. 建立大鼠糖尿病性白內(nèi)障動(dòng)物模型，探討糖尿病大鼠晶狀體混濁的發(fā)生機(jī)制。 2. 探討谷胱甘肽乙酯滴眼液（glutathione ethyl ester，GSH-EE）對(duì)鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的大鼠糖尿病性白內(nèi)障的作用及其機(jī)制。 3. 初步探討肌肽（carnosine，Car）對(duì)高濃度葡萄糖（high glucose，HG）誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制。 方法：對(duì)6

2、6 只大鼠行裂隙燈檢查，排除晶狀體病變。隨機(jī)抽取10 只大鼠作為正常對(duì)照組（A 組），腹腔注射0.02 mol/L 枸櫞酸緩沖液（65 mg/kg，pH 4.5）。56 只大鼠完全隨機(jī)分為谷胱甘肽乙酯治療組（B 組）和糖尿病未治療組（C 組），腹腔注射1％鏈脲佐菌素（65 mg/kg）枸櫞酸緩沖液，血糖>14 mmol/L 的大鼠作為糖尿病大鼠，注射STZ 前5d 正常組和糖尿病未治療組給予25 mmol/L 磷酸鈉緩沖液（pH 7.4

3、）、治療組大鼠給予0.1％谷胱甘肽乙酯磷酸鈉緩沖液，滴雙眼，2/d。每4wk 監(jiān)測大鼠血糖，每周監(jiān)測大鼠尿糖和體重的變化。通過裂隙燈觀察并記錄大鼠晶狀體混濁的進(jìn)展。晶狀體混濁分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)采用英國牛津大學(xué)眼科實(shí)驗(yàn)室方法。4、8、13wk 時(shí)處死大鼠，取出晶狀體，測定其中水溶性蛋白質(zhì)、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和糖基化終產(chǎn)物含量（advanced glycation end products，AGEs）以及谷胱甘肽還原酶（glu

4、tathione reductase，GR）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性。 在高糖誘導(dǎo)人晶狀體細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)上，加入不同濃度的肌肽作用于細(xì)胞，采用MTT 比色法確定高糖和肌肽作用濃度。晶狀體上皮細(xì)胞分為三組，并在體外培養(yǎng):正常組(DMEM)、高糖組(DMEM+120 mmol/L 高糖)，肌肽治療組(DMEM+120 mmol/L 高糖+25 mmo1/L 肌肽)。高糖孵育24、48、72、96h 時(shí)分別取各組晶

5、狀體上皮細(xì)胞裂解上清液，用分光光度法測定測定晶狀體上皮細(xì)胞中的凋亡相關(guān)酶Caspase-3 的活性變化。同時(shí)在光學(xué)顯微鏡利用細(xì)胞凋亡原位法（TUNEL）檢測凋亡的晶體上皮細(xì)胞，并計(jì)算上皮細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果： 1. 注射鏈脲佐菌素后72 h，糖尿病大鼠血糖（C 組29.43±5.23 mmol/L）較正常大鼠血糖（A 組6.99±0.42 mmol/L）顯著升高（P<0.05），在實(shí)驗(yàn)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，糖尿病大鼠始終保持高血糖和

6、較低體重。 2. 糖尿病未治療組大鼠鏈脲佐菌素注射后第3 wk 晶狀體開始出現(xiàn)混濁，其混濁表現(xiàn)為兩階段進(jìn)展，鏈脲佐菌素注射后第3～6 wk 晶狀體混濁進(jìn)展緩慢，第7～13 wk 晶狀體混濁進(jìn)展迅速。 3. 谷胱甘肽乙酯治療組大鼠鏈脲佐菌素注射后第4 wk 晶狀體開始出現(xiàn)混濁，第4 wk 時(shí)谷胱甘肽乙酯治療組大鼠晶狀體混濁程度顯著低于糖尿病未治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在注射STZ 后5wk，各糖尿病組的晶狀

7、體混濁程度明顯加重，并且各組之間進(jìn)展程度沒有明顯差異。 4. 以正常組大鼠為標(biāo)準(zhǔn)，糖尿病治療組大鼠晶狀體中GSH含量及CAT，GR 活性顯著下降（P<0.05）。注射鏈脲佐菌素后第4、8 wk，谷胱甘肽乙酯治療組與糖尿病未治療組大鼠晶狀體中谷胱甘肽的含量（mg/gprot，4 wk: 80.32±10.02 vs 68.44±9.05；8 wk: 56.62±9.82vs 50.27±8.43）相比，分別增加了17.5％和12.

8、6％，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。各個(gè)時(shí)間點(diǎn), 谷胱甘肽乙酯治療組與糖尿病未治療組大鼠晶狀體中過氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶和糖基化終產(chǎn)物比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示谷胱甘肽乙酯可以抑制晶狀體中GSH 含量下降。 5. 肌肽對(duì)高糖誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞系SRA01-04 的存活率有顯著的提高作用，選取晶狀體上皮細(xì)胞的存活率為50％時(shí)肌肽濃度（25 mmol /L）作為實(shí)驗(yàn)藥物濃度。 6. 25 mmo1/ L 的肌肽作用

9、于人晶狀體上皮細(xì)胞可降低其Caspase-3 活性。高糖孵育48、72、96 h 后肌肽治療組Caspase-3 活性分別比高糖組低11％（P>0.05）、22％ （P<0. 05）和8％（P>0.05）。 7. TUNEL 檢測結(jié)果顯示肌肽可抑制晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率。晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率隨高糖孵育時(shí)間延長而增高。高糖孵育48、72、96 h 后肌肽治療組晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率分別比高糖組低4％（P>0.05）、13％（P<0.

10、05）和5％（P>0.05）。 結(jié)論： 1. 鏈脲佐菌素大鼠是研究糖尿病性白內(nèi)障的理想模型，本實(shí)驗(yàn)顯示注射鏈脲佐菌素后4 wk，大鼠晶狀體已經(jīng)出現(xiàn)白內(nèi)障早期特征性改變。 2. 谷胱甘肽乙酯滴眼液局部應(yīng)用對(duì)糖尿病大鼠是安全的，它能抑制早期糖尿病性白內(nèi)障的進(jìn)展，但到了中晚期糖尿病，谷胱甘肽乙酯的這種作用就逐漸減弱，推測其作為合成谷胱甘肽的前體，保護(hù)巰基氧化，進(jìn)而維持晶狀體透明及其功能。 3. 高糖可通過Cas

11、pase-3 的活化，使晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。肌肽可以抑制高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞增殖率的下降，Caspase-3 酶活性升高和人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡。 創(chuàng)新點(diǎn)： 1.首次把GSH-EE 滴眼液用于糖尿病性白內(nèi)障的實(shí)驗(yàn)研究，避免了重復(fù)腹腔注射引起的多發(fā)感染等全身副反應(yīng)，也簡化了操作，滴眼液比腹腔注射更適用于眼科臨床。 2.對(duì)糖尿病大鼠晶狀體的抗氧化體系和糖基化終產(chǎn)物進(jìn)行了動(dòng)態(tài)檢測，有利于了解糖尿病性白內(nèi)障發(fā)展過