戊二醛聚合血紅蛋白氧載體類新藥開發(fā)基礎(chǔ)研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)部分主要建立一種從豬血中快速大量分離純化超高純度天然豬血紅蛋白的方法。首先，采用生理鹽水多遍離心洗滌新鮮豬血，獲取紅細(xì)胞(RBC)，以除去基質(zhì)成分(血漿、白細(xì)胞等)；將洗滌后RBC置于4℃低滲溶液裂解紅細(xì)胞，再用4℃高速離心，以除去大的細(xì)胞碎片和細(xì)胞膜成分，而取得豬血紅蛋白粗制品。隨后，通過不同的離子交換層析系統(tǒng)對(duì)粗制品豬血紅蛋白樣品進(jìn)行純化，制得超高純度的豬血紅蛋白。然后，通過一系列合適的試驗(yàn)方法(蛋白質(zhì)電泳、掃描光譜、SEC-

2、FPLC、蛋白質(zhì)印跡等)，對(duì)純化后血紅蛋白的純度、濃度、產(chǎn)率和生物學(xué)活性進(jìn)行定量、定性檢測(cè)，從而形成一套血紅蛋白提純品自檢鑒定標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用上述提取、分離純化方法和自檢測(cè)方法，獲得了所提取純化的豬血紅蛋白純度大于99.9％；濃度在8.9-12.5g/dl；無(wú)菌、熱源實(shí)驗(yàn)陰性；SEC-FPLC色譜峰為單一的峰；血?dú)夥治鰞x測(cè)得純化后高鐵血紅蛋白含量低于5％；13.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示，產(chǎn)品呈均一分布，86.5％電泳遷移率約為16.

3、5kD，為血紅蛋白亞基單體；10.2％電泳遷移率近似于32.5kD,為血紅蛋白二聚體；SDS-PAGE銀染-蛋白印跡結(jié)果不僅確定了血紅蛋白的亞基組成及分子量和分布，而且利用血紅蛋白和標(biāo)準(zhǔn)蛋白(BSA、OVA)上樣量不同，間接確定了純化后血紅蛋白的純度。通過上述試驗(yàn)結(jié)果，為制備大量高濃度、超高純度、高質(zhì)量的豬血紅蛋白，提供了技術(shù)基礎(chǔ)。 本研究論文主要探討建立獨(dú)特的微型分子排阻層析(SEC)和蛋白芯片聯(lián)用系統(tǒng)，作為抗人源性血紅蛋白氧

4、載體類興奮劑檢測(cè)方法。SEC和蛋白芯片聯(lián)用檢測(cè)系統(tǒng)主要流程為：自制微型SEC層析柱(Superdex75Micro4/26)分離緩沖液或人血清樣品中的PolyhHb和天然血紅蛋白(加入的內(nèi)標(biāo)豬血紅蛋白)。并逐滴收集層析洗脫液作為探針，使其固定在蛋白質(zhì)基片上，并與其相對(duì)應(yīng)的熒光標(biāo)記的多克隆抗體進(jìn)行雜交。再用掃描儀掃描雜交芯片，采集熒光信號(hào)、進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利用熒光強(qiáng)度確定樣品中是否存在人源性血紅蛋白氧載體。 通過實(shí)驗(yàn)研究，選擇了與文

5、獻(xiàn)所報(bào)道的血紅蛋白氧載體(HBOCs)的分子量分布相似的本實(shí)驗(yàn)室合成的戊二醛聚合人血紅蛋白(PolyhHb)，作為已有人源HBOCs制品的代用樣品。初步確立了微型分子排阻層析(SEC)和蛋白芯片聯(lián)用系統(tǒng)，檢測(cè)抗人源性血紅蛋白氧載體類興奮劑的基本特性和主要條件。自制的Superdex75Micro4/26層析柱，可有效分離PolyhHb中高分子成分和天然Hb，重復(fù)性好、其檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.015g/L；以特異性抗原抗體為檢測(cè)基礎(chǔ)的蛋白芯片

6、技術(shù)，可以進(jìn)一步確定層析分離蛋白質(zhì)樣品中是否存在聚合人血紅蛋白，可作為抗此類興奮劑檢測(cè)的確認(rèn)驗(yàn)證手段。因此，Superdex75Micro4/26層析和以特異性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)為檢測(cè)基礎(chǔ)的蛋白芯片聯(lián)用方法，可以組成抗人源性氧載體類興奮劑檢測(cè)系統(tǒng)，使檢測(cè)結(jié)果的可靠性大大增加。但是，由于層析對(duì)PolyhHb的具有明顯稀釋作用，與已報(bào)道的僅用SEC手段的檢測(cè)方法相比，本文的SEC-蛋白芯片聯(lián)用系統(tǒng)未能提高檢測(cè)人源性氧載體的靈敏度，約為0.5g