可靜脈注射新型納米復(fù)合物載IL-18基因傳遞系統(tǒng)的研究.pdf

1、人類基因組計劃的順利完成，加速了功能基因的闡明和疾病相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)，也加深了人類從醫(yī)學(xué)和生理學(xué)角度對自身的認(rèn)識，使方興未艾的基因治療，成為21世紀(jì)生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點。 隨著腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究不斷深入，人們逐漸認(rèn)識到腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個多因素、多步驟和多基因參與的復(fù)雜過程。其中細(xì)胞因子是一類由免疫細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、單核巨唾細(xì)胞等)和相關(guān)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)產(chǎn)生的調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的高活性、多功能蛋白質(zhì)多肽分子，能激

2、發(fā)、增強(qiáng)機(jī)體產(chǎn)生顯著的抗腫瘤免疫功能，從而達(dá)到治療腫瘤的目的，因此在腫瘤免疫基因治療中已經(jīng)被廣泛用于實驗治療研究。但如果這類蛋白全身性給藥，往往會因為外源性蛋白的免疫原性導(dǎo)致過于強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)而產(chǎn)生毒副反應(yīng)。DNA疫苗由來自病原微生物或腫瘤細(xì)胞有編碼基因的非復(fù)制型DNA質(zhì)粒組成。將編碼不同蛋白的質(zhì)粒接種于體內(nèi)，可導(dǎo)致機(jī)體T細(xì)胞和相應(yīng)抗體對這些蛋白的應(yīng)答，因而提供了一種特異性免疫手段。優(yōu)點有：①沒有導(dǎo)入可能與“減毒”疫苗相關(guān)的強(qiáng)毒力病毒的

3、危險性；②易于大量制備，價格便宜；③可以干粉形式長期保存；④小劑量適當(dāng)?shù)幕驑?gòu)建于即可誘導(dǎo)保護(hù)性免疫；⑤使用一次即能產(chǎn)生長期免疫力。 雖然近20年來基因治療取得了很大的發(fā)展，但當(dāng)前基因治療研究中還存在很多技術(shù)性的難題，其中之一就是治療基因的有效傳輸。目前的基因傳遞系統(tǒng)主要包括病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒載體雖然具有比較高的轉(zhuǎn)染效率，但是它們的生物安全性問題至今尚未得到很好的解決。非病毒載體安全性高，易于大規(guī)模生產(chǎn)，研究主要集

4、中在脂質(zhì)體和高分子載體系統(tǒng)上。這兩種載體作為給藥系統(tǒng)，在藥劑學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)有了廣泛的研究。脂質(zhì)體主要由磷脂組成，生物相容性好，對所攜帶的遺傳物質(zhì)沒有片斷大小的限制，可以通過內(nèi)吞和融合等作用方式進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率相對較高，但穩(wěn)定性較差和主要帶正電荷限制了其在靜脈注射中的應(yīng)用。而高分子基因傳遞系統(tǒng)，也具有很好的生物相容性，很低的生物毒性，生物降解性的特點，且其生產(chǎn)成本低，穩(wěn)定性高，便于結(jié)構(gòu)修飾，是一類更具開發(fā)潛力的載體系統(tǒng)。本課題用聚陽離子多肽

5、一多聚賴氨酸(PLL)與DNA形成縮合物，再采用復(fù)乳一溶劑揮發(fā)法制備PELGE為載體材料的納米多聚復(fù)合物載藥系統(tǒng)PPDs(polymeric-polycationic peptide-DNA，PPDs)，較為系統(tǒng)地研究了載基因的制備處方工藝條件，詳盡地考察了其物理化學(xué)性質(zhì)，體外轉(zhuǎn)染能力及細(xì)胞毒性，并建立了小鼠肺轉(zhuǎn)移腫瘤模型，用PPDs攜帶治療基因mIL-18，進(jìn)行了體內(nèi)藥效學(xué)研究。在此基礎(chǔ)上，我們還對PPDs進(jìn)行了葉酸修飾，提高了其對腫

6、瘤細(xì)胞的靶向性。 首先，我們制備了非病毒表達(dá)載體，對合成的傳遞載體材料(PELGE)進(jìn)行了細(xì)胞毒性評價，篩選出適合以后實驗的材料，詣在將其應(yīng)用于載基因納米粒靜脈注射。實驗利用轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5-α分別擴(kuò)增了需要的報告基因和治療基因，按照試劑盒說明用陰離子交換樹脂分離純化了質(zhì)粒DNA，采用紫外分光光度法測定了其含量，通過計算A<,260>/A<,280>的比值，證明其純度符合要求；我們又采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步考察了質(zhì)粒DNA的

7、純度和構(gòu)型，結(jié)果表明純化產(chǎn)物的純度和構(gòu)型均符合要求。由載體材料PELGE的細(xì)胞毒性試驗可以得出，在實驗給藥的濃度條件下，材料納米粒對血管內(nèi)皮細(xì)胞相容性最好，如靜脈注射后被動濃積于肝臟，毒性也很小，宜于用于血管使用，即靜脈注射。并且鑒于PELGE系列聚合物細(xì)胞毒性和血液相容性研究的綜合考慮，我們選用材料PELGE73進(jìn)行后面的實驗。 隨后，我們采用熒光分光光度法，利用熒光染料Hoechst 33258與DNA結(jié)合發(fā)出熒光的原理，建

8、立了DNA的含量測定方法。我們通過瓊脂糖凝膠電泳和zeta電位的檢測，確定了PLL與DNA的最佳比例(1：1，w/w)和混合介質(zhì)(葡萄糖注射液)，成功地用PLL縮合了質(zhì)粒DNA，為下一步的包封做了必要的準(zhǔn)備。我們采用復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法，以粒徑和多分散指數(shù)(PDI)以及包封率為指標(biāo)，通過單因素試驗篩選了處方工藝條件，以PELGE與PLL/DNA縮合物一起制備了PPDs。用篩選后的處方工藝條件制得的PPDs為較規(guī)則的圓球，平均粒徑為150.9

9、2±9.04nm，PDI為0.15±0.01，zeta電位為-27.31±2.02 mV，包封率為87.99±1.61％。DNA在制備過程中能保持其完整性，制備成PPDs后能有效抵抗核酸酶的降解，質(zhì)量優(yōu)良。對PPDs載體系統(tǒng)物理化學(xué)性質(zhì)的進(jìn)一步考察表明了，該種多聚復(fù)合NP制備的過程中加入了PLL，不僅能有效壓縮DNA，還能在一定程度上保護(hù)DNA免受制備過程中超聲的傷害，并且能有效地防止DNA被體內(nèi)核酸酶降解，更能加強(qiáng)DNA在酸性條件下的

10、穩(wěn)定性，并使得以其為內(nèi)核的PPDs在不同pH條件下帶不同電荷。這都為基因傳遞提供了很好的前提。當(dāng)pDNA與PLL以靜電吸引力作用形成核，再包裹在以生物可降解的mPEG-PLGA-mPEG為殼的納米粒中，就構(gòu)成一種核殼結(jié)構(gòu)的新型載基因系統(tǒng)-PPD(PELGE-PLL-DNA)。這種以PELGE為外殼的載基因系統(tǒng)也具有了更好的生物相容性好，更低的細(xì)胞毒性，在血漿中也有了更強(qiáng)的穩(wěn)定性。 我們運(yùn)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，成功地利用β-半乳糖苷

11、酶和熒光素酶(luciferase)兩種報告基因，考察了PPDs介導(dǎo)外源基因的體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染能力。以β-半乳糖苷酶為報告基因的轉(zhuǎn)染定性地表明了，我們設(shè)計制備的PPDs都能成功的轉(zhuǎn)染HepG2和Hela細(xì)胞，其在顯微鏡下計數(shù)測得的轉(zhuǎn)染率分別大約為3±0.9％和1.2±0.5％，而不含PLL的PELGE納米粒和裸DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中沒有觀察到轉(zhuǎn)染成功的蛋白表達(dá)。 以熒光素酶為報告基因的轉(zhuǎn)染定量地表明了，PPDs轉(zhuǎn)染的HepG 2和Hel

12、a細(xì)胞其表達(dá)出的熒光素酶具有較強(qiáng)的活性，明顯高于裸DNA和不含PLL的PELGE納米粒(p<0.05)，有了數(shù)量級的提高，進(jìn)一步證明了PPDs聯(lián)合應(yīng)用多聚陽離子肽和生物可降解的大分子復(fù)合物的優(yōu)越性。隨后，我們用MTT法考察了空白納米粒的細(xì)胞毒性。為了檢測我們構(gòu)建的質(zhì)粒能否準(zhǔn)確表達(dá)目的基因，我們用pEGFP-C1-IL-18 PPDs轉(zhuǎn)染了腫瘤細(xì)胞，考察了其在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況。我們以外觀、色澤以及再分散性為指標(biāo)，篩選了PPDs的凍干粉

13、針劑處方，制備出的PPDs凍干粉針劑達(dá)到了設(shè)計要求。初步穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，PPDs凍干粉針劑在-20℃冰箱中儲存放置1周之后，其粒徑、zeta電位、包封率以及對核酸的保護(hù)能力與凍干前相比均無明顯變化。 我們建立了小鼠肺轉(zhuǎn)移腫瘤模型，通過尾靜脈給藥，評價了PPDs凍干粉針劑攜帶治療基因mIL-18在體內(nèi)的抗腫瘤效果，并通過與化療藥物順鉑(DPP)聯(lián)用，進(jìn)一步評價了基因藥物與化療藥物的聯(lián)合治療效果。試驗結(jié)果表明，荷瘤小鼠經(jīng)mIL-

14、18-PPDs凍干粉針劑治療后，生存期顯著長于PBS組、空白納米粒組和陽性對照組；mIL-18-PPDs凍干粉針劑與DPP聯(lián)合治療組小鼠的生存期均又顯著長于mIL-18-PPDs凍干粉針劑單獨治療組，說明聯(lián)合治療取得了成功。病理學(xué)及腫瘤組織的檢測結(jié)果表明，在PBS組、空白納米粒組和裸DNA組小鼠的肺臟中，腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)量多、面積大，說明腫瘤的轉(zhuǎn)移較為嚴(yán)重，并且新生灶的生長較快；而在mIL-18-PPDs組、DPP組以及聯(lián)合治療組小鼠的肺臟

15、中，轉(zhuǎn)移灶數(shù)量少、面積小，說明小鼠經(jīng)治療后，腫瘤的生長得到了明顯的控制；其中聯(lián)合治療組幾乎沒有觀察到明顯的轉(zhuǎn)移灶，組織形態(tài)與正常小鼠未見明顯區(qū)別，說明聯(lián)合用藥達(dá)到了很強(qiáng)的抑瘤作用。 此后，鑒于新型構(gòu)建的PPDs載體對傳統(tǒng)納米粒的轉(zhuǎn)染效果提高明顯，我們在PPDs系統(tǒng)中引入葉酸來賦予其靶向性。我們將生物可降解材料換為PELGE的類似物PELGA，由PEG和PLGA聚合形成，再通過酯鍵與葉酸連接，然后按照同樣的復(fù)乳．溶劑揮發(fā)法制成多聚

16、復(fù)合物基因給藥系統(tǒng)。利用細(xì)胞熒光吞噬試驗以及報告基因的表達(dá)考察了系統(tǒng)的靶向性。結(jié)果表明葉酸修飾過的PPDs在Hela細(xì)胞中的攝取明顯提高，報告基因的轉(zhuǎn)染更是有了顯著性的差異，這都表明葉酸的連接，增加了載體系統(tǒng)的靶向性。 綜上所述，我們聯(lián)合應(yīng)用了多聚陽離子肽和生物可降解的大分子復(fù)合物，可望將其作為一種平臺技術(shù)，用于制備非病毒基因傳遞系統(tǒng)。本課題制備的新型納米多聚復(fù)合物基因傳遞系統(tǒng)能有效介導(dǎo)目的基因的體內(nèi)外轉(zhuǎn)染，為設(shè)計構(gòu)建種新型、有