人Elafin基因重組轉染對氣道上皮完整性的維護作用.pdf

1、目的：構建人中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑Elafin(elastase-specificinhibitor)重組載體，探討其轉染表達對氣道上皮完整性維護的分子機制，為將重組Elafin用于臨床治療氣道慢性氣道炎癥性疾病提供理論和實驗基礎。 方法：(1)抽提人肺總RNA進行逆轉錄反應，經(jīng)PCR擴增目的基因片段，將其克隆于綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)表達載體pEGFP-C1上，經(jīng)酶切電泳、DN

2、A測序鑒定分析構建是否成功。(2)將構建的重組質(zhì)粒pEGFP-C1-Elafin轉染入A549細胞，將其與多形核粒細胞(polymorphonucleargranulocyte,PMN)共孵育，經(jīng)脂多糖(1ipopolysacc~de，LPS)刺激24h后，用Westembolt檢測細胞中緊密連接相關蛋白zonulaoccludens-1(ZO-1)表達、MTI'法測定細胞與膠原附著能力、底物法測定培養(yǎng)上清中中勝粒細胞彈f生蛋白酶(ne

3、utrophilelastase,NE)的活}生及ELISA檢測上清中Elafin的水平。1 結果：(1)經(jīng)PCR獲得459bp的產(chǎn)物，經(jīng)酶切、DNA測序，確定所擴增片段為人Elafin基因cDNA，進而成功篩選出表達載體pEGFP-Cl—Elafin，。轉染后的A549細胞中有Elafin基因表達。(2)Westembolt發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPS刺激后，轉染空載體的A549細胞中ZO-1的表達明顯降低，而轉染重組質(zhì)粒的細胞中ZO-1的表

4、達未見明顯降低。且MIT法發(fā)現(xiàn)LPS刺激后轉染空載體的細胞與膠原附著能力明顯下降，而轉染重組質(zhì)粒的細胞與膠原的附著能力未見明顯下降。底物法測定培養(yǎng)上清中NE的活性發(fā)現(xiàn)轉染重組質(zhì)粒細胞培養(yǎng)上清液中NE活性與轉染空載體細胞相比較明顯降低。ELISA檢測上清中Elafin的分泌情況顯示LPS刺激24h后，轉染Elafin+LPS組培養(yǎng)上清液中Elafin含量與未加刺激因素轉染Elafin的細胞相比較明顯降低。 結論：成功構建了重組質(zhì)粒