pvdQ基因在人腸道上皮細胞中的表達作用以及對銅綠假單胞菌致病性影響的研究.pdf

1、目的：觀察銅綠假單胞菌Quorum sensing （QS）系統(tǒng)信號分子3OC12-HSL對人腸道上皮細胞系Caco-2活力及細胞凋亡的影響作用及其深入機制。構(gòu)建銅綠假單胞菌?；妇幋a基因pvdQ的真核表達載體，并檢測其在腸道上皮細胞中的表達及其表達對3OC12-HSL分子的抵御作用。
　　 方法：利用不同濃度3OC12-HSL（100-300uM）分別干擾Caco-2細胞4小時后，采用MTT法檢測Caco-2細胞干擾前后細胞活

2、性的變化及利用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡變化，并使用western blot方法檢測Caco-2細胞中凋亡相關(guān)蛋白p38/MAPK及NFκB表達變化。構(gòu)建pvdQ基因真核表達載體并使其在Caco-2細胞中表達。用3OC12-HSL分子干擾表達pvdQ基因的Caco-2細胞，利用3OC12-HSL分子感應(yīng)菌株E.coli MG4檢測干擾前后Caco-2細胞上清液中3OC12-HSL分子活性變化，利用質(zhì)譜分析儀檢測干擾前后Caco-2細胞上清液

3、中3OC12-HSL分子濃度變化，同時利用流式細胞術(shù)檢測3OC12-HSL分子對表達pvdQ基因Caco-2細胞凋亡的影響作用。
　　 結(jié)果：MTT結(jié)果顯示，3OC12-HSL分子能抑制Caco-2細胞活性（P<0.05），流式細胞術(shù)結(jié)果表明，3OC12-HSL能促進Caco-2細胞發(fā)生細胞凋亡（P<0.05），且呈劑量依賴性。同時，western blot結(jié)果顯示，3OC12-HSL分子干擾細胞后，p-p38/MAPK及NFκ

4、B蛋白表達水平增加。pvdQ基因真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Caco-2細胞后，利用western blot方法檢測到PvdQ在Caco-2細胞中表達，感應(yīng)菌株E.coli MG4檢測結(jié)果表明，pvdQ基因在Caco-2細胞中表達能有效減弱Caco-2細胞上清液中3OC12-HSL活性。質(zhì)譜分析結(jié)果表明，pvdQ基因能降低Caco-2細胞上清中3OC12-HSL分子濃度，且呈時間依賴性（P<0.05）。流式細胞術(shù)結(jié)果表明，pvdQ基因在Caco-2

5、細胞中表達可抵御3OC12-HSL分子促進Caco-2細胞凋亡的作用。
　　 結(jié)論：銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)信號分子3OC12-HSL能抑制腸上皮細胞Caco-2細胞活性，促進細胞發(fā)生凋亡，其機制可能與3OC12-HSL分子調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白p38/MAPK及NFκB蛋白表達相關(guān)。成功構(gòu)建帶有銅綠假單胞菌pvdQ基因的真核表達質(zhì)粒Pires2-EGFP-pvdQ，并轉(zhuǎn)染入人腸道上皮細胞Caco-2，pvdQ基因在Caco-2細胞中表達