銅綠假單胞菌Las系統(tǒng)信號(hào)分子對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的影響.pdf

1、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)俗稱綠膿桿菌，屬革蘭陰性桿菌，廣泛分布于水、空氣、土壤及醫(yī)院環(huán)境中，同時(shí)也是人體的正常菌群。本菌的感染多見于皮膚粘膜受損部位，如燒傷、創(chuàng)傷等，也見于因長期化療或使用免疫抑制劑的患者。在醫(yī)源性感染中由本菌引起者約占10％，在某些特殊病房中，如燒傷和腫瘤病房、各種導(dǎo)管和內(nèi)窺鏡的治療與檢查室內(nèi)，本菌感染率可高達(dá)30％。它是一種能引起急慢性感染的機(jī)會(huì)致病菌，特別是引起肺部感染。它

2、是引起囊性肺纖維化、彌漫性泛支氣管炎及支氣管擴(kuò)張癥等病人死亡的主要病原體。由于其對(duì)抗生素的耐藥性使其感染幾乎不可能被清除而導(dǎo)致肺衰竭最終導(dǎo)致死亡。這促使人們開始致力于研究其感染的機(jī)制，從而從根本上尋找新的抗感染途徑。
　　 近年來的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可以根據(jù)特定信號(hào)分子的濃度來監(jiān)測周圍環(huán)境中自身的數(shù)量變化，當(dāng)信號(hào)分子達(dá)到一定的閾值濃度時(shí),可與相應(yīng)受體結(jié)合，激活菌體中相關(guān)基因的表達(dá)來適應(yīng)環(huán)境中的變化,完成這一信號(hào)傳導(dǎo)的普遍存在于革蘭陰性

3、菌和革蘭陽性菌中的系統(tǒng)被稱為細(xì)菌密度感知信號(hào) (Quorum-sensing，QS)系統(tǒng)。在革蘭陰性菌中，對(duì)QS系統(tǒng)研究最為深入的是銅綠假單胞菌，該菌的信號(hào)系統(tǒng)在調(diào)控銅綠假單胞菌各種毒力因子表達(dá)中起重要作用。隨著對(duì)該系統(tǒng)的深入研究，已經(jīng)證實(shí)細(xì)菌細(xì)胞間信號(hào)系統(tǒng)是由參與毒力基因表達(dá)的調(diào)控多基因組成的，同時(shí)也明確了細(xì)胞間信號(hào)系統(tǒng)基因群是一個(gè)復(fù)雜的級(jí)聯(lián)系統(tǒng)。這個(gè)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)包括兩個(gè)主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子lasR和rhlR和幾個(gè)其它組成元素。近年來又發(fā)現(xiàn)

4、了銅綠假單胞菌的由QS系統(tǒng)控制并且調(diào)控lasB的轉(zhuǎn)錄的喹諾酮信號(hào)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)。
　　 目前的研究成果表明，Las系統(tǒng)在銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)中位于信號(hào)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的頂層。LasR-3-oxo-C12-HSL復(fù)合物可以正向調(diào)控rhlR和rhlI的轉(zhuǎn)錄；喹諾酮信號(hào)系統(tǒng)中的醌類物質(zhì)(PQS)是連接Las系統(tǒng)和Rhl系統(tǒng)的紐帶。不論在哪一個(gè)細(xì)胞間信號(hào)系統(tǒng)中，Las系統(tǒng)均處于中心地位。當(dāng)細(xì)菌密度較低的時(shí)候，僅產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的3-oxo-C12-HSL

5、，當(dāng)密度升高時(shí)，3-oxo-C12-HSL亦隨之升高直至閾值濃度，此時(shí)3-oxo-C12-HSL便和LasR結(jié)合，LasR-3-oxo-C12-HSL復(fù)合體主導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控并激活下游特定基因的轉(zhuǎn)錄，從而激活包括綠膿菌素等在內(nèi)的一系列致病因子的表達(dá)。近年來已有研究提示密度感知系統(tǒng)本身就可能是一種毒力因子，并且可以直接作用于宿主細(xì)胞，抑制宿主免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致機(jī)體更易于被感染。綜合以前學(xué)者的研究討論工作，強(qiáng)烈提示信號(hào)分子能夠改變銅綠假單胞菌感染

6、后的宿主免疫反應(yīng)并可能是宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子。
　　 宿主體內(nèi)存在著比較完善的免疫系統(tǒng)。該系統(tǒng)由免疫器官、免疫細(xì)胞以及免疫分子組成。在感染免疫過程中，各免疫器官、組織、細(xì)胞和免疫分子間互相協(xié)作、互相制約、密切配合，共同完成復(fù)雜的免疫防御功能。而致病菌侵入人體后，首先遇到的是固有免疫功能的抵御。固有免疫主要由組織屏障和某些免疫細(xì)胞、免疫分子等組成。而巨噬細(xì)胞作為機(jī)體重要的分泌細(xì)胞因子的固有免疫應(yīng)答細(xì)胞，具有吞噬顆粒性抗原

7、及吞飲可溶性抗原的作用。此外，巨噬細(xì)胞作為炎癥階段的主要吞噬細(xì)胞，負(fù)責(zé)清除機(jī)體損傷處組織和細(xì)胞的壞死碎片以及病原體等，這些物質(zhì)對(duì)創(chuàng)傷愈合過程都有重要的調(diào)控作用。因此，巨噬細(xì)胞的活化對(duì)于機(jī)體早期抗感染免疫具有一定作用。故以巨噬細(xì)胞凋亡和吞噬等細(xì)胞行為學(xué)變化為研究靶點(diǎn)，可成為篩選和開發(fā)新型免疫調(diào)節(jié)藥物的新策略。我們通過化學(xué)合成銅綠假單胞菌Las系統(tǒng)信號(hào)分子3-oxo-C12-HSL分子，觀察其對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7的基本生物效應(yīng)，

8、為進(jìn)一步研究細(xì)菌與宿主之間相互作用提供初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 本研究工作分以下二個(gè)部分：
　　 一、銅綠假單胞菌Las系統(tǒng)信號(hào)分子3-oxo-C12-HSL對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞活力及凋亡影響的檢測1、銅綠假單胞菌Las系統(tǒng)信號(hào)分子3-oxo-C12-HSL對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞活力影響的檢測挑選一瓶狀態(tài)好的細(xì)胞用0.25％的胰酶消化吹打混勻成密度約為8×106/ml的細(xì)胞懸液，以200μL/孔

9、的量接種到96孔培養(yǎng)板中（周邊孔用PBS填充）37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，細(xì)胞貼壁生長，將孔板中的培養(yǎng)基棄去，加入不含胎牛血清的DMEM200μL/孔，各孔分別加入信號(hào)分子3-oxo-C12-HSL 使其終濃度為100,50,25,12.5,6.25μM及對(duì)照孔（加等量的DMSO），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，信號(hào)分子3-oxo-C12-HSL作用2h或4h后吸去孔中培養(yǎng)基，用PBS洗兩遍，然后加入180μL/孔不含胎牛血清的DMEM并同

10、時(shí)加入20μL/孔 MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h,4h后將上清棄去，每孔加入DMSO150μL，低速振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解后在酶標(biāo)儀上測各孔的OD490nm。通過得到的各孔OD值的大小間接反映各孔細(xì)胞的活力。
　　 2、銅綠假單胞菌Las系統(tǒng)信號(hào)分子3-oxo-C12-HSL對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞凋亡的影響挑選一瓶狀態(tài)好的細(xì)胞用0.25％的胰酶消化吹打混勻成密度合適的細(xì)胞懸液(8×106/ml)，以3ml/孔的量接

11、種到6孔板中37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，細(xì)胞貼壁生長，將孔板中的培養(yǎng)基棄去，加入新鮮的培養(yǎng)基同時(shí)加入信號(hào)分子3-oxo-C12-HSL使其終濃度為100,50,25,12.5,6.25μM及對(duì)照孔（加等量的DMSO），作用4h后按照Annexin Ⅴ-FITC/PI雙標(biāo)凋亡檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）及Caspase 3,8,9活性檢測試劑盒說明操作，分別上流式、酶標(biāo)儀或熒光顯微鏡檢測結(jié)果，比較不同濃度信號(hào)分

12、子引起細(xì)胞的凋亡情況。
　　 二、銅綠假單胞菌Las系統(tǒng)信號(hào)分子3-oxo-C12-HSL對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞吞噬功能的影響1、銅綠假單胞菌Las系統(tǒng)信號(hào)分子3-oxo-C12-HSL對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞吞飲中性紅的影響挑選一瓶狀態(tài)好的細(xì)胞用0.25％的胰酶消化吹打混勻成密度約為8×106/ml的細(xì)胞懸液，以200μL/孔的量接種到96孔培養(yǎng)板中（周邊孔用PBS填充）37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2

13、h后細(xì)胞貼壁，加入信號(hào)分子3-oxo-C12-HSL 使其終濃度為100,50,25,12.5,6.25μM及對(duì)照孔（加等量的DMSO），繼續(xù)孵育2h，棄去培養(yǎng)基加入中性紅生理鹽水（0.7％）200μL/孔37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中孵育1h，用PBS洗三次，然后加入細(xì)胞裂解液200μL/孔，4℃過夜。酶標(biāo)儀測定各孔的OD490nm。間接反映各孔細(xì)胞對(duì)中性紅的吞飲能力。
　　 2、銅綠假單胞菌Las系統(tǒng)信號(hào)分子3-oxo-C12-

14、HSL對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7吞噬銅綠假單胞菌的影響挑選一瓶狀態(tài)好的細(xì)胞用0.25％的胰酶消化吹打混勻成密度合適的細(xì)胞懸液（8×106/ml），以3ml/孔的量接種到6孔板中37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，細(xì)胞貼壁生長，將孔板中的培養(yǎng)基棄去，加入新鮮的培養(yǎng)基同時(shí)加入信號(hào)分子3-oxo-C12-HSL使其終濃度為100,50,25,12.5,6.25μM及對(duì)照孔（加等量的DMSO），作用2h，然后加入0.2ml/孔的PAO1

15、生理鹽水銅綠假單胞菌懸液（銅綠假單胞菌數(shù)量與細(xì)胞數(shù)的比例約為100:1），與細(xì)胞37℃共孵育1h后用PBS充分洗三次，瑞氏染色后在油鏡下觀察計(jì)數(shù)分別得到吞噬率和吞噬指數(shù)。
　　 結(jié)論：本研究通過對(duì)加不同濃度3-oxo-C12-HSL后的小鼠巨噬細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞膜、線粒體、caspase酶活性及其吞噬能力的變化，說明銅綠假單胞菌Las系統(tǒng)信號(hào)分子3-oxo-C12-HSL對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7具有免疫抑制作用，可以降低