微生物來源藥物的篩選、分離及結(jié)構(gòu)表征研究.pdf

1、傳統(tǒng)的活性成分篩選與表征，往往需要進行物理化學方法的分離純化，經(jīng)體內(nèi)體外活性篩選后，由傳統(tǒng)的UV、IR、NMR、MS結(jié)合其他結(jié)構(gòu)表征技術(如X-衍射、熱分析等)確定活性成分的結(jié)構(gòu)，整個過程繁瑣耗時，工作量巨大，特別是很多活性成分含量極微，穩(wěn)定性較差，要滿足篩選與結(jié)構(gòu)表征所需的樣品量，其工作難度和工作量都是十分巨大的，因此嚴重影響了篩選的效率和篩選的成果。 本課題采用高通量體外篩選，篩選出能夠生產(chǎn)活性成分的微生物，經(jīng)分離放大培養(yǎng)、

2、色譜純化，得到微量的活性成分，采用NANONMR進行結(jié)構(gòu)表征。課題采用了高通量體外篩選與核磁共振NANO技術相結(jié)合，提高了活性成分篩選的命中率，大大減少了工作量，同時NANO技術的采用不僅減少了結(jié)構(gòu)表征所需樣品量，提高了工作效率，而且使活性成分的結(jié)構(gòu)表征更為準確，建立了新的天然藥物篩選與結(jié)構(gòu)表征平臺，此類藥物篩選模式尚未見報道。 本文在篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑過程中，分離得到一個活性化合物N98-1272D，經(jīng)波譜分析確認其為一新

3、的開鏈多烯類抗生素。本文首次用NANONMR技術報道了N98-1272D的結(jié)構(gòu)，準確歸屬了1H和13CNMR化學位移，并確定了其立體構(gòu)型。首次報道了其對AchE的抑制活性，對以后的結(jié)構(gòu)改造和開發(fā)成新藥有很好前景。 本文在篩選免疫抑制劑過程中，首次從國產(chǎn)菌株中篩選到免疫抑制劑霉酚酸的產(chǎn)生菌，該產(chǎn)生菌為一新菌種，而且具有目標產(chǎn)物純化相對容易的特點，為今后免疫抑制劑霉酚酸產(chǎn)業(yè)化提供了一條新的途徑。本文首次對霉酚酸碳氫信號進行了全指定，

4、為該化合物的研究提出了有益的資料，為此類化合物的結(jié)構(gòu)解析提供了譜學依據(jù)。 通過本課題的研究表明，與傳統(tǒng)的篩選方法相比，NANONMR技術更適用于對微量活性化合物進行藥物篩選工作。 一、微生物來源的乙酰膽堿酯酶抑制劑N98-1272D的篩選、分離及結(jié)構(gòu)表征研究 目的：建立微生物來源的乙酰膽堿酯酶(Acetylcholi-nesterase，簡稱AChE)抑制劑的高通量篩選方法，經(jīng)篩選找到有抑制活性的發(fā)酵液，從中分離

5、純化獲得高純度活性化合物并確定其結(jié)構(gòu)。 方法：1微生物來源的乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選 從新疆、云南土壤中分離得到的放線菌，經(jīng)斜面轉(zhuǎn)移，培養(yǎng)基發(fā)酵，得到發(fā)酵液，加入等體積95％乙醇抽提，渦旋混合后室溫放置2h，離心(3000rpm，10min)，取上清液在冷凍旋轉(zhuǎn)濃縮儀上蒸去乙醇，水相用1.5ml乙酸乙酯提取，振蕩后靜置，取乙酸乙酯溶液1.2ml，在冷凍旋轉(zhuǎn)濃縮儀上蒸去乙酸乙酯，作為篩選待用樣品。 2微生物來源乙酰

6、膽堿酯酶抑制劑篩選通過樣的純化建立乙酰膽堿酯酶抑制劑篩選模型，將有抑制活性的菌種保藏并大規(guī)模培養(yǎng)，然后對其發(fā)酵液進行乙酸乙酯提取、薄層層析、硅膠柱層析和制備型HPLC分離純化，獲得具有抑制活性的高純度化合物。 3活性化合物結(jié)構(gòu)確定 將獲得的高純度活性化合物進行紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜、NANONMR測定，通過圖譜解析確定其化學結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：1活性化合物的分離純化 在對2141株菌株的篩選中，得到一株陽性菌

7、N98-1272，培養(yǎng)N98-1272，經(jīng)一系列發(fā)酵過程后，從鏈霉菌發(fā)酵物中用乙醇分離提取，蒸去乙醇，用乙酸乙酯提取，對乙酸乙酯提取物進行TLC檢測，經(jīng)硅膠柱層析，對收集到的組分進行活性測定，活性組分在氯仿：甲醇為10:2時被洗脫，收集活性組分，經(jīng)Sep-packODS柱層析后，用HPLC制備，流動相為乙腈-水溶液(90:10)，流速為6.0ml/min。收集活性峰，濃縮抽干得到的黃色粉末(N98-1272D)2.3mg。 2N

8、98-1272D結(jié)構(gòu)的確定 對收集的微量活性化合物進行UV、IR、FAB-MS、NANONMR測定，綜合解析后確定了其化學結(jié)構(gòu)如下： 結(jié)論：1本實驗首次基于NANONMR技術建立了一套微生物來源乙酰膽堿酯酶抑制劑的高通量篩選方法，使分離純化一次的微量活性樣品即可確定其分子結(jié)構(gòu)，具有方便、快速、準確的特點，國內(nèi)外均未見相同報道。 2本實驗篩選分離得到一個活性化合物N98-1272D，該化合物對乙酰膽堿酯酶的IC50

9、為0.075mg/ml。經(jīng)波譜分析確認其為一新的開鏈多烯類抗生素。該類化合物具有抗真菌、抗癌等活性，但對AchE的抑制活性為首次發(fā)現(xiàn)。 3本文首次準確歸屬了開鏈多烯類抗生素N98-1272D1H和13CNMR化學位移及立體構(gòu)型，各相關質(zhì)子間的偶合常數(shù)與其結(jié)構(gòu)相符合，并且將NMR研究得到的結(jié)果與計算機分子模擬的結(jié)構(gòu)相比較，取得了一致結(jié)論。 二、微生物來源的免疫抑制劑M01-669A的篩選、分離及結(jié)構(gòu)表征 目的：建立

10、微生物來源的免疫抑制劑的篩選方法，經(jīng)篩選找到有抑制活性的發(fā)酵液，從發(fā)酵液中分離純化獲得高純度活性化合物并確定其結(jié)構(gòu)。 方法： 1微生物來源的免疫抑制劑的篩選 從新疆、云南土壤中分離得到的放線菌，經(jīng)斜面轉(zhuǎn)移、培養(yǎng)基發(fā)酵，發(fā)酵液加等體積乙醇浸泡，離心，取上清液蒸干乙醇，用乙酸乙酯提取，乙酸乙酯提取物作為篩選用樣品。 2微生物來源免疫抑制劑篩選通過樣的純化 建立啤酒酵母基因工程菌免疫抑制劑篩選模型，將有

11、抑制活性的菌種保藏并大規(guī)模培養(yǎng)，然后對其發(fā)酵液進行乙酸乙酯提取、薄層層析、硅膠柱層析和制備型HPLC分離純化，獲得具有抑制活性的高純度化合物。 3活性化合物結(jié)構(gòu)確定 將獲得的高純度活性化合物進行紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜、NANONMR測定，通過圖譜解析確定其化學結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：1活性化合物的分離純化 通過篩選2352個菌株，發(fā)現(xiàn)M01-669的發(fā)酵液具有抑制活性。對M01-669發(fā)酵液用乙酸乙酯提取，對乙酸

12、乙酯提取物進行TLC檢測，硅膠為60F254，經(jīng)硅膠柱層析，對收集到的組分進行活性測定，收集活性組分，活性成分經(jīng)HPLC制備，流動相為55％乙腈-水，流速為6.0ml/min，收集活性峰，濃縮干燥得到活性化合物M01-669A2.1mg。@2M01-669A結(jié)構(gòu)的確定 對收集的微量活性化合物進行UV、IR、FAB-LC、NANONMR測定，綜合解析后確定了其化學結(jié)構(gòu)如下：ThechemicalstructureofM01-669

13、A 結(jié)論：1本文在對免疫抑制劑的篩選中，得到一株陽性菌M01-669，培養(yǎng)M01-669，得到的發(fā)酵液通過硅膠層析和HPLC制備，得到活性組份M01-669A，經(jīng)解析證實與免疫抑制劑霉酚酸結(jié)構(gòu)一致，這是首次從國產(chǎn)菌株中分離到該化合物。 2M01-669A產(chǎn)生菌為一新菌種，而且具有目標產(chǎn)物純化相對容易的特點，如果通過對本研究發(fā)現(xiàn)的霉酚酸產(chǎn)生菌進行誘變育種并實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，能夠大大降低免疫抑制劑霉酚酸的生產(chǎn)成本和提高產(chǎn)品質(zhì)量。