球孢白僵菌硫醇-二硫化物氧化還原酶系和兩個內(nèi)吞標志位點蛋白的功能解析.pdf

1、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是經(jīng)典的絲狀昆蟲病原真菌，被廣泛用于農(nóng)林害蟲的生物防治。基于球孢白僵菌的制劑在田間應(yīng)用中常遭受高溫、陽光紫外輻射、化學農(nóng)藥等環(huán)境因子的脅迫制約，影響其生物防治潛能的發(fā)揮。除了環(huán)境脅迫因子，生防真菌在進入昆蟲體內(nèi)后還會遭遇到由寄主細胞免疫應(yīng)答所引起的脅迫。因此，開展白僵菌抗逆生物學研究，揭示抗逆性狀的分子基礎(chǔ)及其對生防潛能的影響，是合理應(yīng)用生防真菌制劑防治農(nóng)林害蟲的科學依據(jù)。在田間環(huán)境及宿

2、主體內(nèi)雙重脅迫作用下，真菌細胞不可避免地被活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)損傷。谷氧還蛋白-谷胱甘肽氧化還原酶系(Glutaredoxin-Glutathione Reductase，GRX-GLR)及硫氧還蛋白氧化還原酶系(Thioredoxin-Thioredoxin Reductase，TRX-TRR)是真菌及其重要的抗氧化機制，是抵御ROS損傷含硫生物大分子的主要屏障。然而,這兩大抗氧化酶系

3、在昆蟲病原性絲狀真菌中的生物學功能目前知之不多。因此，研究這兩大酶系內(nèi)部的相互作用及其與超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、過氧化氧酶(Catalase，CAT)、過氧化物酶(Peroxidase，POD)及抗氧化小分子谷胱甘肽(Glutathione，GSH)之間的互作關(guān)系,對于理解GRX-GLR及TRX-TRR保護真菌細胞的作用和機理，進而明確它們對真菌生防潛能的貢獻，具有重要的意義。此外，細胞膜結(jié)構(gòu)

4、對于維持細胞存活狀態(tài)及正常功能發(fā)揮具有決定性作用。內(nèi)吞標志性位點(eisosome)作為重要的細胞膜結(jié)構(gòu)域，具有穩(wěn)定細胞構(gòu)象、應(yīng)答及傳遞胞內(nèi)外環(huán)境信號、攝取營養(yǎng)元素等重要作用。 Pil1和Lsp1是兩個主要的組裝蛋白，參與內(nèi)吞標志性位點的構(gòu)建。因此，本研究包含三個方面的工作，一是研究GRX-GLR酶系抗逆生物學功能及其對毒力的貢獻，二是解析TRX-TRR酶系功能及其可能的互作關(guān)系，三是就Pil1/Lsp1的細胞自噬調(diào)控作用及其生防潛能影

5、響開展了較詳盡的研究。主要研究內(nèi)容及成果分述如下:
　　球孢白僵菌GRX-GLR酶系的抗氧化功能解析谷氧還蛋白酶(Grx)是負責調(diào)控胞內(nèi)硫醇-二硫化物氧化還原的一類蛋白，與硫氧還蛋白酶系具有重疊且又有所區(qū)分的生物學功能。球孢白僵菌擁有五個GRX家族成員(Grx1-5)和一個谷胱甘肽還原酶(Glr)。根據(jù)保守位點的不同，五個GRX成員可分為三類，即二硫醇谷氧還蛋白Grx1(保守活性位點為CPY/FC)，單硫醇谷氧還蛋白Grx2-4(

6、活性位點為CGFS或CS/PYS)以及類似谷氧還蛋白的蛋白Grx5(活性位點為CPDC)。grx或glr的單基因缺失,在正常條件下一般可通過其余同伴基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)而得到補償。最特別的是grx3，它的轉(zhuǎn)錄上調(diào)可補償氧化脅迫條件下grx1、grx2、grx5或glr的缺失，而它自身的缺失在正常條件下只能靠不可敲除的grx4的轉(zhuǎn)錄上調(diào)而得到補償，或是靠其余同伴基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)而應(yīng)對甲萘醌的氧化脅迫。結(jié)果是細胞氧化還原狀態(tài)受干擾的程度以△glr為

7、甚，其次是△grx3，但在其余grx敲除株中受干擾不明顯。正常培養(yǎng)條件下的SOD總酶活是△grx1-3敲除株顯著高于野生株，但在甲萘醌脅迫下SOD總酶活是△grx5和△glr敲除株顯著低于野生株。不管有無過氧化氫脅迫，各敲除株的CAT總酶活都有不同程度的上升，而POD總酶活在△glr中的下降幅度大于△grx3。在脅迫應(yīng)答中，△grx3僅對上述兩種氧化劑敏感性有所上升，△glr不僅對上述兩種氧化劑而且對硫醇氧化劑和硫醇還原劑的敏感性都有所

8、上升。有趣的是，所有敲除株都對Fe3+更敏感，并伴隨兩個Fe3+轉(zhuǎn)運蛋白基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)。生防潛能相關(guān)表型在除△grx5之外的敲除株中都或多或少地有所改變。敲除株的所有變化都在回補株中懨復到野生株的水平。結(jié)果表明，在球孢白僵菌依賴于Glr的氧還系統(tǒng)與SOD、CAT、GSH-POD抗氧化酶系的互作關(guān)系，Grx3在系統(tǒng)中扮演著比其余同伴更為關(guān)鍵的角色。
　　球孢白僵菌硫氧還蛋白的功能解析硫氧還蛋白(Trx)具有還原硫化物、為二硫化物的還

9、原過程提供電子等功能。通過這一還原功能,Trx能夠保護細胞免受ROS的損傷。球孢白僵菌擁有比其他真菌更多的硫氧還蛋白家族成員(Trx1-6)。通過在野生菌株中表達融合蛋白Trxx::eGFP(x=1，2，…，6）并對轉(zhuǎn)基因細胞進行特異性染色分析，證明Trx1-4、Trx5及Trx6分別定位在細胞質(zhì)、細胞核膜及線粒體中。各Trx的單基因敲除導致其他家族成員的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，說明六個家族成員之間至少存在轉(zhuǎn)錄水平上的互補效應(yīng)。與野生株相比，

10、只有△trx2對甲萘醌的敏感性顯著上升，而包括△trx2在內(nèi)的所有trx敲除株對H2O2的響應(yīng)都無變化。有趣的是，將trx敲除株與甲萘醌共培養(yǎng)，SOD總酶活僅在△trx2中表現(xiàn)劇烈下降。與此同時，菌絲細胞內(nèi)還原/氧化型谷胱甘肽比率在△trx2中僅有0.4,而在包括野生菌在內(nèi)的其他受試菌株中比值維持在1.0上下。除此之外，產(chǎn)孢、萌發(fā)、耐熱、耐紫外以及毒力等生防潛能相關(guān)性狀在所有敲除突變株中都有或多或少的改變。
　　兩個硫氧還蛋白還原

11、酶(Trr1/2)的功能解析及其作用的Trx成員硫氧還蛋白還原酶Trr通過招募還原性輔酶NADPH使其自身獲得將氧化型Trx還原的能力，并與之組成硫氧還蛋白氧還酶系統(tǒng)。在酵母細胞中,Trx與Trr根據(jù)亞細胞定位分區(qū)而自然配對。但球孢白僵菌擁有都定位于細胞質(zhì)的Trr1和Trr2同源蛋白，但各自與六個Trx成員之間的靶向關(guān)系不明。雖然trr2缺失導致部分trx基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)，但trr1缺失引起更多trx基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)且幅度更大，而且僅有trr

12、1的缺失時才誘發(fā)半胱氨酸營養(yǎng)缺陷、Trx總活力上升、POD及SOD總酶活下降等重要變化。有趣的是，在△trr1中超表達trx1、trx6或trr1時，上述表型缺陷被完全回復，而超表達trx2/3/4/5或trr2都無法挽救細胞的上述缺陷。這些結(jié)果意味著，Trr1可能通過還原Trx2-5而在白僵菌硫氧還蛋白氧還系統(tǒng)中發(fā)揮著主導作用,Trr2可能還原Trx1和Trx6而起著系統(tǒng)備份的作用。
　　兩個內(nèi)吞標志位點蛋白(Pil1與Lsp1

13、)對球孢白僵菌的細胞自噬與生防潛能的調(diào)控作用細胞膜在細胞生長、營養(yǎng)攝取以及胞內(nèi)外信號接收、傳遞等方面起著舉足輕重的作用。內(nèi)吞標志位點(eisosome)是定位于質(zhì)膜且標有內(nèi)吞位點的大型雜合蛋白復合體，能夠容納脂質(zhì)、轉(zhuǎn)運蛋白、信號分子等，因而是細胞膜正常行使功能所必不可少的。球孢白僵菌的內(nèi)吞標志位點中有Pil1及Lsp1兩個主要結(jié)構(gòu)蛋白，均定位于膜下側(cè)的細胞周質(zhì)，且呈不連續(xù)的斑點狀。盡管二者共同定位在內(nèi)吞位點的標志性結(jié)構(gòu)域上，但各自的定位

14、不需互為前提，這明顯區(qū)別于釀酒酵母中Pil1的正確定位是Lsp1定位在結(jié)構(gòu)域上進行組裝所必須的。在白僵菌中，pil1的缺失能刺激細胞自噬，導致囊泡中的自噬體顯著增大，而lsp1的缺失卻完全抑制細胞自噬發(fā)生，導致在囊泡中無法形成自噬體。這些觀察與21個自噬基因的轉(zhuǎn)錄表達水平基本一致，即在△pil1表現(xiàn)為全面上調(diào)，而在△lsp1中絕大多數(shù)自噬基因的表達卻大幅下調(diào)，尤以自噬前體形成最密切的atg8在△lsp1中下調(diào)幅度最大。顯然，Pil1和L

15、sp1具有直接或間接調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子繼而調(diào)控細胞自噬體形成及狀態(tài)的功能,分別起著負向和正向調(diào)控細胞自噬的作用。作為膜結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白，pil1和lsp1的缺失還引發(fā)細胞對多種脅迫應(yīng)答的顯著相反變化。有趣的是，所有這些變化在雙敲除菌株中都表現(xiàn)為朝野生株方向回復的趨勢。此外，二者的單基因敲除株和雙敲除株的產(chǎn)孢能力、孢子活力、耐高溫及抗紫外輻射等生防潛能相關(guān)性狀，都發(fā)生顯著不同的變化，侵染昆蟲的能力則嚴重受損，尤以雙敲除株受損最嚴重。結(jié)果表明，Pil